halleri
B.1. Les messagers de défensines s’accumulent dans les parties aériennes chez A. halleri
L’expression des gènes de défensines a été analysée par northern blot dans les plants d’A. halleri ayant servi à l’extraction des ARN pour la construction de la banque d’ADNc. Ces plants d’A. halleri, cultivés en terreau pendant 3 mois, ont été rempotés sur terre contaminée en zinc puis les parties aériennes et les racines ont été récoltées après 1 semaine. La sonde utilisée pour le northern blot correspond à l’ADNc
AhPDF1.1 dans sa pleine longueur. La proximité des séquences nucléotidiques des
ADNc de défensines isolées chez A. halleri ne permet pas de définir une sonde spécifique pour une analyse en northern blot. La sonde utilisée hybride au moins avec les ADNc AhPDF1.1, AhPDF1.2, AhPDF1.3 et AhPDF1.4. Cette sonde a permis de détecter l’accumulation des messagers de défensines dans les parties aériennes (Figure III.25). Cependant, dans nos conditions d’hybridation, aucune accumulation des messagers n’est détectée dans les racines (Figure III.25).
D’après ces résultats, l’expression des gènes de défensines est majoritairement localisée dans les parties aériennes chez A. halleri. Nous avons donc restreint la suite de l’étude à l’expression des défensines dans les parties aériennes.
B.2. Détection des protéines PDF chez A. halleri
Un sérum dirigé contre une défensine de radis (RsAFP2) a été utilisé afin de détecter, par des analyses de western blot, la présence de défensines dans les parties aériennes chez A. halleri.
Des extraits protéiques ont été réalisés à partir de plantes d’A. halleri et A.
Résultats
La visualisation de protéines de petite taille n’est pas aisée, et plusieurs mises au point des conditions de détection ont dues être réalisées. Les protéines ont été séparées par électrophorèse SDS-PAGE en gel d’acrylamide (10/18%) dans un tampon Tris-tricine (Figure III.26a). Après transfert, les protéines ont été fixées sur la membrane par un traitement glutaraldéhyde (12,5%) qui améliore la fixation des petites protéines.
Un extrait protéique réalisé à partir de feuilles d’A. thaliana a été utilisé comme contrôle. Dans les deux extraits d’A. thaliana et A. halleri, le sérum anti-RsAFP2 a permis la détection d’une unique bande, très proche du front de migration, et dont la taille peut être estimée entre 3 et 5 kD (Figure 26b). En effet, l’estimation de la taille des petites protéines est délicate car elles peuvent ne pas être uniformément chargées en SDS. Néanmoins, ce poids moléculaire apparent est cohérent avec la masse moléculaire des protéines matures calculée d’après la séquence polypeptidique (5,71 ; 5,54 ; 5,57 ; 5,71 kD pour les protéines AhPDF1.1, AhPDF1.2, AhPDF1.3 et AhPDF1.4, respectivement).
Dans la littérature, la formation de multimères de défensines en l’absence d’agents réducteurs dans l’extrait protéique a été décrite pour des défensines extraites de différentes espèces de Brassicacées (Terras et al., 1993). Nous avons préparé un extrait protéique à partir de feuilles d’A. halleri, sans ajout de DTE (Figure III.26c). L’analyse en western blot de cet extrait a montré la présence d’une bande supplémentaire, aux alentours de 15 kD, ainsi que d’une bande de très faible intensité aux alentours de 20 kD (Figure III.26d). La présence de ces formes protéiques spécifiques à l’extrait sans traitement réducteur suggère que les défensines d’A. halleri pourraient former des multimères d’au moins 3 ou 4 sous-unités, stabilisés par des ponts disulfures intermoléculaires. Cependant nous n’avons pas déterminé si cette oligomérisation est un effet de l’extraction ou si elle a une signification in vivo.
D’après les résultats décrits ci-dessus, les PDF détectées chez A. halleri correspondraient, selon leur taille, à la partie mature seule sans le peptide signal. En effet, le poids moléculaire de la protéine entière est d’environ 8 kD. De plus, les résultats obtenus par micro-séquençage puis par RMN de la protéine RsAFP1 purifiée (Terras et al., 1992; Fant et al., 1998) ont montré que la forme mature de la protéine ne
Résultats
comprenait pas de peptide signal. Ce peptide signal prédit une localisation extracellulaire. Qu’en est-il de la localisation des défensines chez A. halleri ?
B.3. Immunolocalisation des défensines dans les parties aériennes chez A. halleri
Grâce à l’utilisation du sérum anti-RsAFP2, des expériences d’immuno-localisation ont été réalisées à partir de coupes de feuilles d’A. halleri (Figure III.27). Ces coupes ont subi deux traitement immunologiques : le premier avec un sérum anti-RsAFP2, le second avec un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome. Lors de l’excitation du fluorochrome, un fort signal est détecté sur les coupes (Figure III.27b,c,d,f,h), par observation au microscope confocal. Ce signal est absent lorsque les coupes n’ont été traitées qu’avec l’anticorps secondaire (Figure III.27a,e,g), indiquant que le signal provient effectivement de la détection des anticorps anti-RsAFP2. Sur les coupes de feuilles d’A. halleri, le signal est détecté au niveau de l’épiderme mais également du mésophylle, et au niveau des tissus conducteurs (Figure III.27b). Plus précisément, la fluorescence est localisée au niveau pariétal et cuticulaire (Figure III.27c,d) mais également au niveau cytoplasmique (Figure III.27d). Aucune fluorescence liée au fluorochrome n’est observée dans les chloroplastes, ni dans la vacuole (Figure III.27d). Des coupes partielles de trichomes ont également pu être analysées. La fluorescence est détectée à l’intérieur de la majorité des trichomes (plus de 95% des cas, Figure III.27f). Enfin, au niveau des fleurs, la fluorescence est détectée de façon intense dans les anthères, sans qu’une localisation plus précise puisse être déterminée pour ces organes (Figure III.27h). Aucun signal n’a été détecté dans les pétales (non montré).
Résultats
Ces résultats suggèrent que, dans les parties aériennes d’A. halleri, les PDF sont présentes au niveau des feuilles, à la fois dans les parois et dans le cytoplasme des cellules du mésophylle, et au niveau des anthères.