PCA é uma técnica não supervisionada que reduz a dimensionalidade da matriz de dados original, retendo a quantidade máxima de variabilidade (porcentagem de variância explicada), e que permite a visualização do arranjo original das amostras em um espaço n-dimensional (geralmente 2 ou 3 dimensões), identificando as direções nas quais a maior parte da variância é retida, permitindo uma relação entre variáveis e as observações a serem estudadas, assim como também permitindo reconhecer a estrutura de dados. É, por conseguinte, possível explicar as diferenças entre as várias amostras, por meio dos elementos obtidos a partir da matriz de correlação generalizada dos conjuntos de dados, e ao mesmo tempo para determinar quais as variáveis que mais contribuem para a diferenciação (CRUZ et al., 2013).
HCA é um método de reconhecimento não supervisionado depadrões, que representa os dados multidimensionais em um gráfico bidimensional (dendrograma), utilizando uma técnica aglomerativa: considera inicialmente cada amostra como um grupo unitário, e faz agrupamentos sistematicamente, por ordem de similaridade(BARKER; RAYENS, 2003). Nas análises por HCA, a similaridade
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foi calculada através da distância euclidiana entre as amostras e as conexões foram realizadas conforme o método de Ward.
Figura 4-8: Análises quimiométricas no modo positivo de ionização de todos os órgãos vegetais dos pés francos:A-PCA – gráfico de scores de PC1xPC2 ; B- HCA- dendrograma de similaridade
Figura 4-9:Análises quimiométricas no modo negativo de ionização de todos os órgãos vegetais dos pés francos:A-PCA – gráfico de scores de PC1xPC3 ; B- HCA- dendrograma de similaridade
A projeção das amostras no novo sistema de eixos (PC’s) é visualizada através do gráfico de scores (Figura 4-8-AeFigura 4-9-A). Os gráficos de scores da análise de todos os dados dos espectros de massas no modo positivo e negativo de ionização mostram a separação das amostras em dois grandes grupos. As amostras das raízes aparecem mais distantes, encontrando-se na área negativa do gráfico. As amostras das folhas e caules estão mais próximas, ocupando a parte superior do gráfico. Estes gráficos indicam que ambos levarão a dendrogramas similares.
Nas analises tanto os resultados em modo positivo (Figura 4-8-B) quanto em modo negativo (Figura 4-9-B), foram observados 2 grupos, um deles formado
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exclusivamente por amostras oriundas da raiz e o segundo se dividindo em outros dois correspondendo a analitos do caule e das folhas. Essa separação em dois grupos era esperada considerando o poder de previsão da quimiossistemática. Ou seja, é bem conhecido que as raízes de C. limoniacomo porta-enxerto ou sozinho, e as deC. sinensissão riquíssimas em cumarinas, as quais aparecem como traços nos demais órgãos. Isso será confirmado em analises quimiométricas discutidas em itens afrente, usando espectrometria de massas e analises quimiométricas supervisionadas (s-plot), o qual permite identificar os respectivos íons que mais diferenciam nesses órgãos.
Esse grupo é subdividido em dois, correspondendo a amostras das raízes deC. sinensis e C. limonia (em vermelho e preto, respectivamente Figura 4-8-B e Figura 4-9-B). Isto também seria esperado, pois várias cumarinas são identificadas nas raízes das duas espécies, porem em diferentes concentrações, o que será confirmado nas analises mais afrente. O segundo grupo é subdividido em dois, correspondendo às amostras do caule e das folhas, cujos órgãos compartilham alguns flavonoides, praticamente ausentes nas raízes. Os flavonoides são mais abundantes em concentração e números nas folhas, levando a sua separação do grupo dos caules. O perfil químico do Citrus permite essa explicação, a qual também será confirmada nas próximas discussões. Dentro desses dois grupos verifica-se uma subdivisão separando as respectivas espécies, o que com certeza ocorreu devido à diferença na área das bandas correspondentes. Esses resultados auxiliarão nas próximas analises via S-plot, permitindo prever o perfil químico distinto para as raízes, similares nos demais órgãos, diferenciando em concentração.
Os dendrogramas obtidos com os dados oriundos no modo positivo ou negativo de ionização são similares na separação dos dois grupos e como estes foram subdivididos. Contudo ao nível de separação das respectivas espécies notam-se algumas diferenças, por exemplo, no modo positivo de ionização FCSI1 e FCSI3 compartilham alguns íons não comuns em FCSI2, enquanto observa-se o contrario no modo negativo, FCSi1 se separa de FCSi2 e FCSi3 compartilham alguns íons não comuns em FCSi1. Ou seja, nota-se que há algumas diferenças, mas no geral pode-se dizer que o uso de ambas as ionizações podem levar a bons resultados em análise envolvendo a identificação dos respectivos metabólitos.
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A importância (peso) de cada variável na descrição dos eixos (componentes) é apresentada no gráfico de PCA de loadings. Nesse gráfico além dos círculos representando as amostras, tem-se também triângulos que representam diferentes íons detectados no experimento. Quanto mais próximo o triângulo de um determinado grupo de amostras, mais esse íon é representativo desse grupo. Íons equidistantes entre 2 ou 3 grupos indicam que os mesmos apresentam abundância semelhante nos diferentes grupos de amostras. NaFigura 4-10 e Figura 4-11, tem-se o gráfico de loandings com todos os órgãos estudados em um único gráfico no modo positivo e negativo, respectivamente. Nesse gráfico é possível verificar a existência de íons que são característicos para cada parte da planta. Apesar de mostrar quais são os íons que mais contribuem para a diferenciação entre as amostras e diminuir o numero de íons que teria que ser investigado na tentativa de identifica-lo, esse tratamento quimiométrico não faz uma discriminação da confiabilidade e do quanto esses íons estão variando nas análises sendo, portanto, necessário uma análise mais refinada que diminuirá a dimensionalidade dos dados obtidos, por isso nessas análises de PCA de loadings não foi discriminado aqui o número de íon e quais são eles.
Dessa maneira, as matrizes de cada órgão foram novamente reavaliadas separadamente em pares de órgão no qual se teve por objetivo avaliar suas diferenças através das análises discriminantes de s-plot.
Figura 4-10 Análise de PCA: gráfico de loadings da PC1 X PC2 das análises realizadas no modo positivo de ionização dos órgãos vegetais.
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Figura 4-11 Análise de PCA: gráfico de loadings da PC1 X PC3 das análises realizadas no modo negativo de ionização dos órgãos vegetais.
4.3.5 Análises discriminantes dos biomarcadores via S-plot dos pés francos