Chapitre IV. Les cellules souches mésenchymateuses
5. Les limitations de l’application des CSM dans la médecine régénérative
Malgré ces études prometteuses, il est nécessaire de signaler que certaines limitations empêchent l’application des MSC dans la réhabilitation régénérative. Parmi ces limitations, on peut citer le processus de vieillissement qui modifie la fonctionnalité des CSM. Ainsi, leur activité proliférative diminue de manière significative en fonction de l’âge, ce qui limite leur potentiel de différentiation (Hwang 2014). La tumorigenése est l'un des grands obstacles dans la thérapie cellulaire basée sur les CSM. En fait, il est possible qu'un petit nombre de cellules s'échappe et se développe dans le site de la greffe pour former une tumeur (Kim & de Vellis 2009). Également, il est possible que ces cellules acquièrent des mutations malignes qui les transforment en cellule cancéreuses (Reya et al. 2001; Miura et al. 2006). D'autres limites sont liées au côté pratique de l'application des CSM allant de la manipulation à la
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commercialisation, ce qui rend difficile l’industrialisation de ces procédés. En effet, il est très important d'assurer des lignées cellulaires pures et non pas portantes des contaminations croisées avant que les thérapies par les CSM soient commercialisées (Torsvik et al. 2010).
Finalement, pour conclure d’une manière fiable à propos du potentiel thérapeutique des CSM, il est essentiel de mettre en place des processus efficaces et reproductibles d'isolement, de culture et de différenciation, de manière à obtenir une population homogène de CSM pour l’utilisation dans des applications cliniques. Ceci reste l'un des plus grands défis pour la réalisation d’un plus grands succès, voir une révolution, dans ce domaine.
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L’histoire de Cavβ remonte à plusieurs décennies, cette protéine a été découverte suite à la purification et l’identification du DHPR en 1984. À cette époque, elle a été définie comme une sous-unité régulatrice des CCDVs, dont les principales fonctions consistent à contrôler l’adressage du canal à la membrane plasmique, sa régulation ainsi que ses propriétés biophysiques. En conséquence, durant les deux dernières décennies, la sous-unité Cavβ était considérée comme étant uniquement le partenaire de la sous-unité Cavα1. Néanmoins, après l’enchainement des études fonctionnelles, d’autres fonctions ont été dévoilées et attribuées spécifiquement à Cavβ.
Parmi les 4 isoformes de Cavβ, nous nous sommes intéressés à l’isoforme neuronale Cavβ4 et son rôle nucléaire. Cette isoforme est principalement exprimée dans le cerveau et dans les cellules de Purkinje et les cellules granulaires du cervelet. En effet, la première évidence d’une fonction propre à Cavβ, ainsi indépendante du canal, a montré qu’un variant de Cavβ4 peut interagir avec la protéine nucléaire (HP1γ) et passer ensuite dans le noyau pour réguler la transcription génique. Plus récemment, B56δ, la sous-unité régulatrice de la PP2A a été décrite comme un nouveau partenaire de Cavβ4. Cette interaction favorise la translocation nucléaire de Cavβ4 où elle organise un complexe protéique avec TRα qui participe à la régulation de la transcription. Le point commun entre ces études est que ces fonctions indépendantes du canal nécessitent la translocation de Cavβ vers le noyau afin de participer à la régulation génique. Même si cette responsabilité génique semblait être une fonction commune à toutes les sous-unités Cavβ, des exceptions ont été récemment décrites. En fait, il a été montré que la translocation nucléaire de Cavβ4 varie entre les différents variants d’épissage; en conséquence, leur aptitude à participer dans des processus épigénétiques dépend de leur capacité de rentrer dans le noyau.
Ces études renforcent l’hypothèse parlant de la réversibilité de l’interaction entre Cavβ et Cavα1. Cette réversibilité laisse le choix à Cavβ d’être présente au niveau membranaire où elle régule le canal, dans le cytoplasme où elle interagit une gamme de protéines intracellulaire et ou dans le noyau où elle intervient dans la régulation de la transcription. Également, elles surlignent la divergence des fonctions de Cavβ et ainsi leur importance pour le fonctionnement cellulaire. L'importance de Cavβ4 neuronale aussi repose sur le fait que les mutations qui touchent cette sous-unité sont associées à une variété de pathologies humaines. En effet, une mutation du gène CACNB4 humain correspondante à une terminaison prématurée (R482X) génère une protéine tronquée de 38 a.a du coté C-terminal (Cavβ1-481).
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Cette mutation a été décrite chez des patients atteints d’une épilepsie juvénile myoclonique. Outre les différences décrites dans la régulation du canal calcique, ce mutant montre des difficultés dans l’adressage nucléaire comparé à la sous-unité Cavβ4 sauvage.
D’autre part, les études structurales révèlent que l’interaction entre Cavβ et Cavα1 ne nécessite que peu d’éléments structuraux de Cavβ, permettent ainsi de penser à d’autres interactions moléculaires fortement favorables. Pareillement, la ressemblance, du point de vue structural, entre Cavβ et les protéines de la famille MAGUK suggèrent un rôle de Cavβdans l’échafaudage protéique.
Récemment, notre équipe de recherche a dévoilé que l’expression de Cavβ4 dans un système d’expression hétérologue montre une modification dans le niveau d'expression d'un ensemble de gènes. Étant donné que parmi ces gènes certains sont impliqués dans la prolifération cellulaire, l’objectif de mes travaux de thèse était de rechercher le rôle potentiel de la sous-unité Cavβ4 dans la prolifération cellulaire. Ce travail a été réalisé en exprimant d’une manière stable Cavβ4, dans un système d’expression hétérologue de cellules CHO, et en étudiant ainsi l'impact de la protéine sur la prolifération et le cycle cellulaire. Une étude comparative a été réalisée avec le mutant épileptique Cavβ1-481 qui montre des difficultés de translocation nucléaire. En effet, ce mutant n’influence que peu la cinétique du canal, ainsi, le phénotype neurologique caractérisé par les crises épileptiques ne peut pas être expliqué uniquement par cette dérégulation. Dans d’autres termes, c’est possible que le défaut de translocation nucléaire du mutant ainsi que son incapacité à accomplir certaines fonctions nucléaires soit à la base du phénotype épileptique.
Également, je me suis concentré sur l’identification de nouveaux partenaires protéiques de Cavβ4, ainsi que des nouvelles voies de signalisation qui peuvent témoigner une intervention de Cavβ4. D’un autre côté, une partie de mes travaux de thèse focalisait sur l’étude de l’expression de Cavβ4 au cours de la différentiationneuronale. Ceci a été aussi basé sur des observations préliminaires décrivant une variabilité de l’expression de Cavβ4 au cours de la différentiation neuronale.
Pour la réalisation de cette étude diverses techniques de biologie moléculaire, d’immunocytochimie, de microscopie confocale, de biochimie et de biologie cellulaire ont été utilisées.
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