Signalisation de l’insuline et du PDGF-BB suite à l’activation des PKC ou en condition élevée de glucose
Lors de la stimulation des cellules musculaires lisses en condition normale de glucose avec 10 nM d’insuline ou 1 ng/mL de PDGF-BB, la phosphorylation d’Akt et d’ERK est augmentée comme observé dans la littérature (Bornfeldt, Raines et al. 1994; Jiang, Lin et al. 1999; Sandirasegarane, Charles et al. 2000; Wang, Gurevich et al. 2003). Suite à un traitement au PMA suivi d’une stimulation à l’insuline ou au PDGF-BB, on observe que la phosphorylation d’ERK est plus élevée par rapport à celle observée au sein des CMLv stimulées par le facteur de croissance seul. Cette augmentation de la phosphorylation est principalement due à l’activation des PKC classiques et nouvelles par le PMA qui par la suite entraînera la phosphorylation des résidus thréonine 202 sur ERK 1 et la thréonine 185 sur ERK 2 comme observé chez les CMLv traitées seulement au PMA pendant une heure (Horgan, Cooke et al. 1986; Chang, Lin et al. 1997; Ferrell and Bhatt 1997). La phosphorylation d’ERK n’entraîne pas forcément l’induction de la prolifération, de la survie ou de la migration cellulaire. Dans certaines conditions, cette phosphorylation peut amener à la transcription de gènes d’intérêts, le changement de morphologie et la différenciation cellulaire (Seger and Krebs 1995; Torii, Nakayama et al. 2004; Viala and
Pouyssegur 2004; Yoon and Seger 2006). Quant à la phosphorylation d’Akt par les facteurs de croissance après le traitement au PMA, on constate qu’elle est fortement diminuée contrairement à la phosphorylation d’ERK. Avec le peu de temps d’incubation du PMA dans les cellules, il est peu probable qu’il y ait eu une augmentation de la synthèse protéique d’une ou plusieurs PTP qui entraînerait l’inhibition de la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB. L’hypothèse la plus plausible serait que l’activation des deux familles de PKC, en induisant la phosphorylation directe des résidus sérine et thréonine, aurait pour conséquence un encombrement stérique. Ce phénomène engendrerait une inhibition compétitive bloquant la phosphorylation en tyrosine au niveau de la partie cytosolique du récepteur et l’induction des diverses voies de signalisation. Une étude a montré que la phosphorylation en sérine sur IRS-1 empêchait l’interaction de cette protéine avec Akt inhibant la translocation de GLUT4 à la membrane entraînant une résistance à l’insuline (Draznin 2006). On peut supposer ce même phénomène au niveau du domaine cytosolique du récepteur au PDGF-BB. Puisque l’inhibition de la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB ne peut pas être relié à une PKC en particulier, nous avons adopté une exposition en concentration élevée de glucose afin d’activer plus spécifiquement certaines PKC contrairement au PMA qui active toutes les PKC classiques et nouvelles.
La phosphorylation d’ERK est augmentée en condition élevée de glucose seulement, ce qui peut être due à l’activation de certaines PKC, du stress oxydatif ainsi que par plusieurs autres facteurs (Lu, Greene et al. 1998; Yasunari, Kohno et al. 1999; Li, Peng et al. 2013; del Nogal, Troyano et al. 2014). Par ailleurs, on constate qu’il n’y a aucun changement au niveau de la phosphorylation d’Akt ou d’ERK lors des stimulations à l’insuline ou au PDGF-BB entre la condition normale et celle élevée en glucose. Cette absence de variation est due au fait qu’il n’y avait aucune augmentation de l’expression protéique de diverses PTP. Il est donc nécessaire de laisser les CMLv à une plus longue exposition en concentration élevée de glucose afin d’augmenter l’expression d’une potentielle tyrosine phosphatase qui viendrait inhiber la signalisation de l’insuline et du PDGF-BB. Plusieurs études démontrent que différents types cellulaires doivent être exposées à des concentrations élevées de glucose pendant plus de 24h afin d’augmenter l’expression protéique de SHP-1 et d’inhiber la signalisation de l’insuline, du PDGF-BB et
d’autres facteurs de croissance (Geraldes, Hiraoka-Yamamoto et al. 2009; Chen, Tuo et al. 2012; Mima, Kitada et al. 2012; Drapeau, Lizotte et al. 2013; Denhez, Lizotte et al. 2015). Effet de l’hyperglycémie sur les effets prolifératifs de l’insuline et du PDGF-BB
Lors des essais de prolifération, on constate que l’ajout de 100 nM d’insuline ou 10 ng/mL de PDGF-BB a entraîné l’activation de la phosphorylation d’Akt et d’ERK activant la prolifération cellulaire et permettant l’incorporation du BrdU dans la phase S du cycle cellulaire. Lorsque les cellules sont exposées à des teneurs élevées de glucose, on observe une diminution de cette incorporation correspondant en une baisse de la prolifération cellulaire. Plusieurs articles tendent à démontrer un effet contraire en concentration élevée de glucose, principalement dans un contexte d’athérosclérose où on observe l’accélération de la migration et de la prolifération cellulaire des CMLv (Yasunari, Kohno et al. 1999; Takehara, Kawabe et al. 2000; Li, Peng et al. 2013). Les résultats de l’étude de Yasunari peuvent facilement être expliqués. L’exposition en teneur élevée de glucose se faisait pendant 5 jours dont 3 jours avec l’ajout de 10% de sérum. Le sérum va permettre l’incorporation du glucose et puisqu’il y aura beaucoup plus de glucose incorporé chez les cellules en concentration élevée de glucose, elles pourront dépenser plus d’énergie lors de la prolifération comparativement à la teneur normale de glucose. Dans les deux autres études, la partie méthode explique que la concentration cellulaire lors des essais de prolifération est beaucoup plus élevée que celle utilisée durant mes expériences. Une étude portant sur l’influence de la densité cellulaire sur des myocytes a démontré que la prolifération cellulaire est plus basse chez les cellules ensemencées à forte densité comparativement à une faible densité de cellules (Millart and Seraydarian 1986). Une autre étude a démontré que la teneur élevée de glucose n’entraînait aucun effet sur la prolifération cellulaire des CMLv (Suzuki, Poot et al. 2001). Les effets obtenus lors de nos expériences sont peut-être différents des résultats vus dans la littérature mais la méthodologie est toute aussi différente et les effets inhibiteurs de la prolifération de l’insuline et du PDGF-BB par la teneur élevée de glucose peuvent être tout aussi plausible. Avec ces résultats, le temps d’exposition en condition élevée de glucose devrait être maintenant à 48h chez les CMLv au lieu de 24h afin d’obtenir l’augmentation d’une PTP qui inhiberait la signalisation de ces deux facteurs de croissance.
Effet de l’hypoxie sur l’expression d’HIF-1α et du PDGF-B dans la lignée cellulaire Lors des différents temps d’exposition à une hypoxie sévère à 1% d’oxygène, nous n’avons constaté aucune augmentation de l’expression d’HIF-1α ou du PDGF-B. Ce résultat est très surprenant puisque l’exposition des cellules à l’hypoxie amène avec le temps une baisse de l’oxygène dans la cellule. Cet oxygène ne peut alors plus être utilisé par les prolyl hydroxylases pour mener HIF-1α vers sa dégradation par le protéasome. Il devrait donc y avoir une augmentation graduelle de l’expression d’HIF-1α dans le cytoplasme à celle, plus tardive, du PDGF-B (Katayose, Ohe et al. 1993; Wang and Semenza 1993). En effet, HIF-1α doit se complexer dans le noyau et activer la transcription des gènes, dont celui exprimant PDGF-B, impliqués dans l’angiogenèse. Par la suite, nous avons décidé d’utiliser le chlorure de cobalt afin d’activer chimiquement une hypoxie (Triantafyllou, Liakos et al. 2006). Tout comme nous l’avions observé avec l’hypoxie à 1% d’oxygène, il n’y a aucune variation d’HIF-1α et du PDGF-B. Puisque les CMLv n’ont répondu ni à l’hypoxie biologique ni l’hypoxie chimique, nous en avons déduit que le modèle cellulaire utilisé n’est pas le plus adéquat pour observer les effets exercés par l’hypoxie. Les cellules ont été immortalisées grâce au large antigène SV40, et il est compréhensible que plusieurs fonctions biologiques aient été altérées rendant les cellules moins sensibles à la baisse en oxygène (Ahuja, Saenz-Robles et al. 2005). Ces résultats nous ont donc incités à utiliser un autre modèle de culture primaire par l’extraction de CMLv provenant d’aortes bovines.