Des ligands spécifiques aux RTK modulent l’entrée du HCV

J’ai évalué l’entrée du virus en présence de ligands spécifiques aux RTK dans des modèles de culture cellulaire.

a) Les ligands de l’EGFR stimulent l’entrée du HCV

L’EGF et le TGF-α sont des ligands de l’EGFR bien caractérisés, dont la liaison favorise la dimérisation du récepteur et la phosphorylation subséquente de sa kinase intracytoplasmique (Schlessinger, 2002). Après avoir confirmé l’activité biologique de ces ligands dans nos cellules cibles, j’ai étudié le rôle de l’EGF et du TGF-α sur l’entrée du HCV. La liaison de l’EGF ou du TGF-α à l’EGFR améliore l’entrée des HCVpp dans des cellules Huh7.5.1, des cellules

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CD81 polarisées et des PHH, qui ont été préalablement privées de sérum (Figure 13). De plus, l’effet observé est dépendant de la dose et l’entrée du HCV peut être augmentée de 4 fois suite à l’incubation de cellules avec un ligand de l’EGFR. L’activation de l’EGFR par son ligand peut donc améliorer l’entrée du HCV. De plus, la plus grande affinité de l’EGF pour l’EGFR sur les hepatocytes (Thoresen et al., 1998) peut expliquer les différences observées entre l’EGF et le TGF-α dans l’augmentation de l’entrée des HCVpp.

Figure 13: Modulation de l'entrée du HCV par des ligands de l’EGFR. Des cellules Huh7.5.1, HepG2-CD81 polarisées et PHH ont été mises en culture, puis privées de sérum. Le lendemain, les cellules ont été pré-incubées 1h avec de l’EGF ou du TGF-α à la concentration indiquée, puis infectées avec des HCVpp (HCV-J, 1b) en présence des ligands. Le pourcentage d’entrée des HCVpp dans les cellules Huh7.5.1, HepG2-CD81 polarisées et PHH comparé aux cellules contrôle sans ligand est représenté.

Par ailleurs, le TGF-β, qui ne peut pas se lier à l’EGFR, n’a eu aucun effet sur l’entrée du HCV même à forte dose (1 µg/ml) (Figure 14). Ces données suggèrent que l’interaction directe de l’EGF ou du TGF-α avec le domaine de liaison du ligand de l’EGFR module l’entrée du HCV de manière spécifique.

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Figure 14: Modulation de l'entrée du HCV par un ligand contrôle, le TGF-β. Des cellules Huh7.5.1, HepG2-CD81 polarisées et PHH ont été mises en culture, puis privées de sérum. Le lendemain, les cellules ont été pré-incubées 1h avec du TGF-β à la concentration de 1 µg/ml, puis infectées avec des HCVpp (HCV-J, 1b) en présence du ligand. Le pourcentage d’entrée des HCVpp dans les cellules Huh7.5.1, HepG2-CD81 polarisées et PHH comparé aux cellules contrôle sans ligand est représenté.

Afin de confirmer le rôle du domaine de liaison du ligand de l’EGFR, un test de compétition entre l’EGF et l’inhibiteur de l’EGFR erlotinib a été utilisé. L’incubation de cellules Huh7.5.1, HepG2-CD81 polarisées et de PHH privées de sérum avec de l’EGF à forte dose (1 µg/ml) en présence d’erlotinib (10 µM) inverse l’augmentation de l’entrée des HCVpp due à l’EGF (Figure 15). Ces données confirment que l’erlotinib inhibe l’entrée du HCV en modulant l’activité de l’EGFR.

Figure 15: Modulation de l'entrée du HCV par des ligands de l’EGFR et un inhibiteur. Des cellules Huh7.5.1, HepG2-CD81 polarisées et PHH ont été mises en culture, puis privées de sérum. Le lendemain, les cellules ont été pré-incubées 1h avec de l’erlotinib à la concentration de 10 µM ou du DMSO contrôle (0.7%). Puis, les cellules ont été infectées avec des HCVpp (HCV-J, 1b) en présence d’EGF à la concentration de 1 µg/ml en combinaison ou non avec de l’erlotinib. Le pourcentage d’entrée des HCVpp dans les cellules Huh7.5.1, HepG2-CD81 polarisées et PHH comparé aux cellules contrôle est représenté. ** p<0,005; *** p<0,0005.

En conclusion, l’activation de l’EGFR par liaison de ses ligands est importante pour permettre une entrée accrue du HCV dans les cellules cibles.

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b) Les ligands de l’EphA2 diminuent l’entrée du HCV

Comme le récepteur EphA2 est constitutivement actif et que sa dégradation est modulée par des ligands cellulaires membranaires au cours de contacts de cellule à cellule (Himanen et al., 2010), l'étude de l’activation d’EphA2 induite par un ligand dans un modèle in vitro de culture cellulaire est techniquement plus complexe. Pour étudier le rôle de l’EphA2 et de son ligand dans l’entrée du HCV, nous avons utilisé des ligands solubles éphrine-A1 et -A3 qui peuvent imiter certains mécanismes de contact cellulaire (Walker-Daniels et al., 2002).

L’incubation de l'éphrine-A1 ou -A3 (1 µg/ml) avec des cellules Huh7.5.1, mais pas du ligand contrôle, entraine une petite diminution de l'ordre de 20 % mais hautement reproductible et significative (p<0,0005), de l'entrée du HCV. De plus, cette diminution est dépendante de la densité de la cellule cible (Figure 16).

Figure 16: Des ligands spécifiques d’EphA2 modulent l'entrée du HCV. Des cellules Huh7.5.1 ont été mises en culture à forte et à faible densité (10⁴ cellules/puits de plaque 96 ou 24 puits, respectivement). Le lendemain, les cellules Huh7.5.1 ont été traitées avec 1 µg/mL d’éphrine-A1 ou -A3 solubles avec un tag Fc ou du contrôle correspondant (Fc-tag (Miura et al., 2009)). Puis, les cellules ont été infectées avec des HCVpp (HCV-J, 1b) en présence des ligands. Le pourcentage d’entrée des HCVpp dans les cellules Huh7.5.1 comparé aux cellules contrôle est représenté. *** p<0,0005.

Ces résultats suggèrent que la liaison de ligands spécifiques d’EphA2 entrainant sa dégradation et donc son retrait de la membrane plasmique peut inhiber l’entrée du HCV et confirme donc un rôle d’EphA2 dans le processus d’entrée du HCV.

Des ligands spécifiques d’EGFR ou d’EphA2 modulent donc l’entrée du HCV, ce qui suggère une pertinence fonctionnelle du domaine de liaison du ligand de ces RTK pour l’entrée du HCV.

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