Com base na atividade antioxidante in vitro obtida e com os resultados dos modelos in vivo analisados, um outro aspecto importante a ser investigado seria as possibilidades de os extratos de C.alnifolia obtidos terem primeiramente uma atividade proliferativa em cultura de células para a linhagem celular considerada como normal, e destes extratos poderem ter um efeito antiproliferativo em células tumorais. Nestes ensaios foram utilizadas as linhagens celulares: 3T3, HeLa, SiHa, PC-3, B16-F-10 e PANC-1. A linhagem 3T3 foi utilizada como modelo de uma célula normal, enquanto as linhagens HeLa, SiHa, PC-3, B16-F-10 e PANC-1 corresponderam as linhagens tumorais.
47 Para estes experimentos foi realizado o ensaio de MTT, que mede a atividade mitocondrial das células (Tabela 6). Pode-se observar que para a linhagem celular 3T3, os diferentes extratos nas diferentes concentrações não apresentaram atividade citotóxica, isto é, a porcentagem de crescimento foi ou 100% ou acima de 100%. Quando foi avaliado se todos os extratos analisados teriam atividade antiproliferativa, para as diferentes linhagens tumorais analisadas, foi observado que praticamente todos os extratos, não apresentaram atividade antiproliferativa.
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Tabela 6 - Efeitos proliferativos, em porcentagem (%), de extratos de folhas de Coccoloba alnifolia em diferentes concentrações (100, 250 e 500 µg/mL), em diferentes linhagens de células em 24 h de incubação.
3T3 HeLa SiHa PC-3 B16-F-10 PANC-1
[ ] Hexano 100 120,68 ± 27,23 91,74 ± 19,92 75,59 ± 20,75 109,33 ± 23,12 139,64 ± 26,79 130,58 ± 40,12 250 124,83 ± 44,05 112,44 ± 6,83 83,15 ± 12,66 113,08 ± 17,49 145,54 ± 23,01 162,30 ± 18,52 500 188,97 ± 15,68 103,27 ± 1,77 95,68 ± 14,30 123,72 ± 27,13 104,56 ± 30,87 139,68 ± 28,42 [ ] Clorofórmio 100 132,61 ± 3,41 74,26 ± 1,91 83,43 ± 7,66 117,07 ± 5,83 135,60 ± 83,95 113,97 ± 10,64 250 131,22 ± 20,44 101,68 ± 12,80 98,37 ± 1,24 116,21 ± 11,43 206,72 ± 11,41 145,28 ± 10,74 500 172,54 ± 15,33 99,22 ± 17,64 106,30 ± 3,93 132,68 ± 31,85 264,33 ± 63,63 158,97 ± 0,17 [ ] Etanólico 100 130,19 ± 3,63 112,50 ± 37,64 105,33 ± 7,79 125,51 ± 1,86 84,69 ± 6,51 100,72 ± 6,31 250 117,57 ± 28,21 119,26 ± 16,78 120,36 ± 20,10 125,12 ± 4,42 123,01 ± 18,46 118,93 ± 1,06 500 100,45 ± 30,10 102,37 ± 30,54 122,24 ± 8,19 107,96 ± 10,68 120,18 ± 11,19 111,22 ± 14,92 [ ] Metanol 100 74,69 ± 22,23 88,57 ± 2,58 106,01 ± 1,04 122,33 ± 6,68 287,14 ± 91,82 138,11 ± 28,11 250 67,25 ± 29,26 100,40 ± 3,89 118,88 ± 3,95 114,25 ± 7,24 270,75 ± 68,13 124,17 ± 7,75 500 66,74 ± 6,32 74,26 ± 14,01 111,19 ± 10,36 99,12 ± 3,92 257,63 ± 60,13 137,70 ± 72,86 [ ] Água final 100 69,67 ± 76,06 95,81 ± 11,21 92,45 ± 31,21 125,24 ± 7,60 186,85 ± 76,03 126,62 ± 40,25 250 67,08 ± 32,71 109,16 ± 30,89 106,87 ± 19,22 121,37 ± 2,20 214,59 ± 41,43 151,70 ± 55,60 500 68,81 ± 28,83 83,49 ± 20,88 96,53 ± 22,22 100,87 ± 14,13 243,80 ± 139,33 145,63 ± 37,60 [ ] Água 100 109,96 ± 60,34 92,39 ± 30,05 103,31 ± 8,57 127,17 ± 32,17 133,90 ± 21,36 84,16 ± 4,91 250 68,81 ± 34,60 91,78 ± 5,65 119,19 ± 12,50 109,21 ± 20,20 155,70 ± 50,79 89,09 ± 17,49 500 70,37 ± 16,51 90,20 ± 0,13 99,35 ± 13,43 108,46 ± 7,45 170,46 ± 71,85 90,63 ± 17,25
49
4.6 Atividade antifúngica
Dados da literatura científica para o gênero Coccoloba mostram que este gênero apresenta uma atividade microbiológica (bactérias e fungos). Sendo assim, buscou-se avaliar a atividade antifúngica da C. alnifolia frente ao fungo Candida parapsilosis.
Neste ensaio foi avaliado a potencial atividade antifúngica para os seis extratos obtidos no item 2.2: hexano, clorofórmio, metanol, etanol, água final e água. Sendo utilizados também dois padrões antifúngicos comerciais: Itraconazol e 5- Fluorocitosina. O ensaio foi realizado com o fungo Candida parapsilosis (ATCC). O protocolo utilizado foi do Clinical and Laboratory Standards Institute (CSLI) e os resultados obtidos foram lidos pelos MICs (Concentração de inibição mínima) em 24 h e 48 h. Para esta avaliação, na leitura foram utilizados os scores de 0 a 4, sendo 4 considerado como um crescimento igual ao controle sem droga (da coluna 11) e 0 considerado como um controle de esterilidade (na presença de um dos antifúngicos utilizados).
O resultado obtido apresentado na figura 18 mostrou que para C. parapsilosis nenhum dos extratos, avaliados em todas as concentrações testadas, mostrou inibição no crescimento da levedura, apresentando assim um score igual a 4, obtido no controle sem o antifúngico.
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Figura 18 Atividade antifúngica.
Efeitos dos extratos das folhas da C.alnifolia no crescimento da C. parapsilosis.
Linha A representa as amostras contendo Candida ATCC; Linha B representa amostras contendo Candida ATCC; Linha C representa as linhagens contendo o Extrato Hexano + Candida ATCC; Linha D corresponde aos Extrato Clorofórmio + Candida ATCC; Linha E corresponde ao Extrato Etanólico + Candida ATCC; Linha F corresponde ao Extrato Metanólico + Candida ATCC; Linha G corresponde ao Extrato Água final + Candida ATCC e na Linha H corresponde ao Extrato Aquoso+ Candida ATCC. Coluna 11 – Controle positivo (+) : RPMI + veículo da droga + fungo e na Coluna 12 - Controle negativo (-): RPMI, corresponde a diluição 1:2 em série
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5. DISCUSSÃO
O uso de produtos naturais, dentre os quais, os metabólitos secundários, tem sido em nossa sociedade um sucesso para a esperança de vida, já que no século 20 ajudou a dobrar essa expectativa, pois os produtos naturais apresentam uma melhor absorção e baixa toxicidade ao organismo, eles também possuem mecanismos que podem atingir várias vias para alcançar alvos com maior eficácia terapêutica. Mais de 60% dos 140 agentes anticancerígenos aprovados desde 1940 são produtos naturais. Em 2000, 57% de todas os medicamentos em ensaios clínicos para câncer eram produtos naturais ou seus derivados. No início de 2008, havia 225 medicamentos naturais em processo de testes pré-clinicos, fases clínicas I a III. O sucesso da produção de novos fármacos depende de tecnologias complementares como a descoberta de produtos naturais, genômica, proteômica, metabolômica e biossíntese (DEMAIN, et al., 2011; SIVEEN et al., 2017).
A prospecção de biomoléculas de origem natural com atividade biológica vem crescendo, com o intuito de desenvolver um novo fármaco que não apresente tantos efeitos adversos quanto os medicamentos sintéticos (DUTRA, 2009). Diante disso, na pesquisa aqui apresentada, foram analisadas a composição fiitoquimica, as atividades antioxidantes in vitro e in vivo, a atividade antiproliferativa e a atividade antifúngica dos seis extratos obtidos de Coccoloba alnifolia.
As análises químicas dos seis extratos da C. alnifolia levaram à observação de que açúcares, proteínas e compostos fenólicos estavam presentes em todos estes extratos. Apesar disso, a proporção destes constituintes variou, nos extratos EE, EM, EAF e EA, houve uma abundância de açucares e uma presença moderada de compostos fenólicos, já as proteínas encontradas foram muito baixa para todos os extratos. Contudo, os extratos polares (etanol, metanol, água final e água)
52 apresentaram uma maior concentração de compostos fenólicos, como já relatado por Alam et al. (2013), onde foram avaliados os solventes que melhor extraem os compostos fenólicos e flavonoides, indicando que os solventes polares etanol, metanol e água, são os melhores.
O estresse oxidativo vem sendo associado a diversas patologias, o foco em determinar os antioxidantes naturais parte do pressuposto de que estes estão envolvidos no equilíbrio da homeostase, beneficiando a saúde (LÓPEZ-ALARCÓN et al., 2013). Nos resultados da triagem das folhas da C. alnifolia foram encontrados os constituintes fenóis, flavonoides, núcleos triterpenos e esteroidais, esteroidal insaturado e saponinas. Assim como na análise fitoquímica da Coccoloba acrostichoides para o extrato etanólico foi visto que este apresentou triterpenos, flavonoides, saponinas e taninos, que estão potencialmente envolvidos na atividade antimicrobiana encontrada para as bactérias Micrococcus luteus e Staphylococcus aureus e para o fungo Fusarium oxysporum (COTA et al., 2003).
A análise por HPLC-DAD (Cromatografia líquida de alta performance acoplada a um detector díodo) separa os componentes de uma matriz dependendo da distribuição molecular dos componentes da matriz em duas fases, de Coccoloba cereifera, exibiu presença de flavonoides e proantocianidinas (GUSMAN et al., 2015), corroborando com os resultados encontrados nas CCD (cromatografia em camada delgada), onde nos extratos polares (etanol, metanol, água final e aquoso) avaliados aqui foram encontradas forte presença de flavonoides.
As análises do coeficiente de Pearson demostraram uma correlação positiva entre o teor de compostos fenólicos do extrato da Coccoloba alnifolia e o teste antioxidante Poder redutor, apresentou uma correlação moderada. Já os açucares apresentaram uma correlação muito forte (poder redutor).
53 Diante desses resultados, foi avaliado o efeito antiproliferativo em cultura de linhagem célula normal (3T3) este não foi citotóxico, o que é importante quando se pensa em utilizar um composto em animais. Entretanto, este também não apresentou efeito citotóxico nas diferentes linhagens tumorais utilizadas.
Para atividade antifúngica, os seis extratos testados não apresentaram atividade para a levedura Candida parapsilosis. Autores evidenciaram que o extrato etanol e as frações das partes aéreas de Coccoloba acrostichoides foram testados quanto à atividade antimicrobiana in vitro. Tanto o extrato quanto as frações foram ativas contra as bactérias testadas, já para o crescimento antifúngico a maioria das frações inibiram o crescimento do fungo, especialmente as frações n-hexano e EtOAc (COTA et al., 2003). Já para o Polygonum aviculare (Polygonaceae) que é uma erva comumente distribuída nas regiões do mediterrâneo e costeiras no Egito, também utilizada na medicina folclórica. A atividade dos extratos foi avaliada pela determinação do diâmetro da zona de inibição contra bactérias Gram-negativas e Gram-positivas e fungos, usando-se disco de papel pelo método de difusão. O extrato clorofórmio apresentou uma excelente atividade antimicrobiana contra todas as bactérias testadas e mostrou boa atividade contra todos os fungos testados, exceto Candida albicans (SALAMA et al., 2010).
As atividades antibacterianas e antifúngicas dos extratos brutos de Polygonum persicaria, Rumex hastatus, Rumex dentatus, Rumex nepalensis, Polygonum plebejum e Rheum australe (Polygonaceae) foram testados em seis espécies de bactérias, das quais Citrobacter frundii, Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e Staphylococcus aureus foram as mais suscetíveis. Entre as espécies de fungos testadas, Fusarium solani, Aspergillus flavus e Aspergillus niger foram mais suscetíveis aos extratos brutos (HUSSAIN et al., 2010), A atividade antifúngica dos
54 extratos da raiz e da folha da Coccoloba mollis foi testada em fitopatógenos, sendo testados contra Botryospheria ribis, B. rhodina, Lasiodiplodia theobromae e Fusarium sp, os resultados mostraram-se promissores para o uso como fungicidas (BARROS et al., 2011). Esses resultados dão indicativos de que para fungos do tipo bolor, os extratos da família Polygonaceae apresentam atividade antifúngica, mas para os fungos do tipo levedura, esta atividade não foi encontrada, apoiando o resultado da atividade antifúngica para Candida parapsilosis.
Tais resultados mostram que os extratos etanólico e aquoso apresentaram um potencial antioxidante in vitro maior em relação aos outros extratos, e que mais experimentos devem ser realizados, com o intuito de identificar que outras atividades biológicas estes extratos possuem além do potencial antioxidante. Um outro aspecto importante é a realização da identificação dos compostos químicos presentes nos extratos, para que seja melhor compreendido o papel destes extratos na proteção das células. Também poderá ser explorada outras atividades, com intuito de compreender onde este potencial antioxidante existente está atuando, já que foi capaz de reduzir ERO´s, isto é importante pois quando o desequilíbrio das espécies reativas se instala pode levar a peroxidação lipídica, lesão no DNA, e doenças associadas ao estresse oxidativo.
55
6 CONCLUSÃO
Por fim,
✓ Poder redutor e Sequestro do radical hidroxila, apresentaram atividade antioxidante;
✓ Maior potencial antioxidante foram para os extratos etanólico, metanólico e aquoso;
Com isso, estes resultados mostraram que os extratos obtidos com folhas da planta C. alnifolia foram capazes de promover atividade antioxidante in vitro.
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