Les techniques utilisant une partie du génome

Ces techniques reposent pour la plupart sur l'analyse de fragments obtenus par PCR. La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une amplification élective d’une séquence d’ADN double brin. Elle est effectuée in vitro par extension itérative de deux amorces situées de part et d’autre de la région considérée, grâce à une DNA polymérase. L’amplification est effectuée par la répétition de cycles de dénaturation/ hybridation/ extension qui assure une duplication exponentielle de chaque brin.

De nombreux gènes cibles peuvent être utilisés, mais également des séquences répétées de gènes. Des logiciels permettent de déterminer les conditions optimales d'hybridation (par exemple le logiciel oligo5...) c'est-à-dire la longueur des primers (nombre de nucléotides) et la séquence de ces primers, la température optimale d'hybridation. Les résultats obtenus par différentes équipes de chercheurs sont rassemblées dans des banques de données. Cette mise en commun des découvertes mondiales et leur mise à la disposition des chercheurs permet une avancée plus rapide des connaissances génétiques.

Des séquences d'insertion sont ainsi amplifiées spécifiquement. Les différences du nombre de répétitions des séquences selon les différentes mycobactéries du complexe de

M. tuberculosis permettent de différencier ces mycobactéries.

La sensibilité de la PCR varie entre 86 et 100%, la spécificité entre 98 et 100%. Ces écarts-types dépendent des liquides physiologiques utilisés pour la détection des mycobactéries (49). Le seuil de détection d’ADN est de 10fg d’ADN pour M. tuberculosis par

réaction, soit environ 2 mycobactéries. Ce seuil est valable lors d’une combinaison PCR/hybridation.

Les PCR présentent l’inconvénient de pouvoir être inhibées par certaines substances présentes notamment dans le pus, le mucus ou dans les tissus de biopsie. Les échantillons doivent donc être au préalable traités au chloroforme phénylé

La PCR permet donc non seulement la détection mais également l'identification des mycobactéries.

3.4.1 Les répétitions de séquences spécifiques répétées non en tandem

Exemples de "séquences répétées cibles" pour des mycobactéries appartenant au complexe de

M. tuberculosis : IS6110 et IS 1081

3.4.1.1 L’élément d’insertion IS 6110

Il a été isolé en 1988 par Eisenach et al à partir de M. tuberculosis. C’est la séquence d’insertion la plus importante identifiée dans le complexe M. tuberculosis. IS 6110 est une séquence d’insertion (IS) de 1361 paire de bases. Cette séquence est bien caractérisée:

- elle a une homologie avec la famille IS 3 des enterobacteriaceae, - elle est presque identique à IS 986,

- IS 6110 a d’abord été isolé et identifié comme IS 986 et IS 987 avant que les deux éléments ne soient reconnus comme identiques et appelés IS 6110. Son polymorphisme repose sur la localisation et le nombre de copies (fig.8).

3.4.1.2 Utilisation de IS 6110

Les mycobactéries du complexe M. tuberculosis et les différentes souches d’un genre de ce complexe montrent du polymorphisme génétique (tabl.12 et réf.9,13). Le nombre d’IS6110 et donc la longueur des fragments obtenus par RFLP et la position chromosomique de IS 6110 sont variables. Le polymorphisme lié au nombre en a fait l’élément d’identification des mycobactéries du complexe M. tuberculosis. Cette variation de nombre résulte de recombinaisons.

La comparaison de cette séquence chez plusieurs souches présentes dans une communauté permet d’identifier ou non une identité génotypique (47). La découverte d’une

identité génotypique de souches provenant d’hôtes apparemment sans lien signifie que ce sont des variants d’un même clone et d’un progéniteur commun.

Un index de similarité supérieur à 80% indique qu’il y a eu dissémination de cet ancêtre commun. Les souches les plus présentes en Asie ont des caractères retrouvés dans beaucoup de souches d’Afrique du Sud. Deux hypothèses peuvent être émises. Il y a eu deux routes d’infection dans une communauté rurale ou des modifications génomiques telles que l’ancêtre commun n’est plus reconnaissable.

L’étude de la dynamique de la maladie dans un endroit donné nécessite des échantillons nombreux et variés. L’analyse est meilleure lorsque les échantillons sont bien sélectionnés dans un lieu donné.

3.4.1.3 L’élément d’insertion IS 1081 (52)

Il a été isolé chez M. bovis où il se trouve répété 6 fois. Le polymorphisme des IS 1081 chez les mycobactéries du complexe M. tuberculosis est limité. La différenciation des souches avec IS 1081 est donc impossible. Collins et Stephens ont montré en 1991 que IS1081 n’est pas utilisable pour différencier les souches de M. bovis quand IS 1081 est utilisé comme sonde pour analyse par RFLP.

3.4.2 La région directe répétée : spoligotyping

Le spoligotyping est une recherche de polymorphisme génétique d’espaceurs dans les régions DR. La région DR est une répétition de segments de nucléotides de 36 paires de bases séparés par de courts espaces. Ces régions DR sont amplifiées par PCR et les segments obtenus analysés. C’est la première technique PCR à être largement acceptée par les chercheurs. Les produits amplifiés sont ensuite hybridés avec des oligonucléotides, chacun correspondant à l’un des 43 espaces uniques de séquences d’ADN présents dans les régions DR qui ont été séquencés chez les différentes mycobactéries du complexe M. tuberculosis (tabl. 13). Il s’agit d’une technique appelée «reverse line blot hybridation». La détection des segments d’ADN hybridés est faite par un système de chimioluminescence. En fonction de l’hybridation ou non des 43 séquences, on peut typer les mycobactéries.

Tableau 12 : nombre de copies de IS 6110 chez différentes mycobactéries.

nombre de copies de IS6110 dans le génome

M.tuberculosis 10 à 20

M. bovis 1

M. bovis BCG 1

Figure 8: Localisation sur la carte génomique de M. tuberculosis H37Rv, des séquences d’insertion (18)

Légende :

Mbp : paires de Mégabases IS : séquence d’insertion

Tableau 13 : nombre d’espaceurs chez les mycobactéries

Nombre d’espaceurs entre les séquences

M. tub ssp tub 43

M. bovis 38

Figure 9 : Localisation sur la carte génomique de M. tuberculosis H37Rv des PGRSs. (18)

Légende :

3.4.3 séquences riches en C-G (PGRS) et polymorphisme de restriction

PGRS est une séquence répétée riche en guanine-cytosine (G-C). Les mycobactéries ont une séquence génomique et des plasmides très riches en Guanine (G) et en Cytosine (C). Ainsi, les premières recherches développées sur les PGRS l’ont été sur le plasmide pTBN12.

Par exemple, G et C constituent 66% du génome total de M. tuberculosis (18). Les séquences polymorphes riches en Guanine (G) et en Cytosine (C) sont réparties dans tout le génome (fig.9). Souvent, les amorces utilisées pour les transcriptions contiennent plusieurs fois ces séquences.