Les oxydases des L-acides aminés

Les LAAO (EC1.4.3.2) ont été classées dans la famille des réductases liées au cofacteur Flavine Adenine Dinucleotide (FAD) en raison de la présence de deux motifs extrêmement conservés permettant la liaison à des dinucléotides.

Elles ont été décrites pour la première fois en 1944 par Zeller et Maritz [Zeller et al. 1944]. Les LAAO catalysent la déamination oxydative stéréospécifique d’un acide aminé L en présence d’oxygène pour produire l’α-keto acide correspondant, de l’ammoniac et du peroxyde d’hydrogène (H2O2) via un intermédiaire imino acide (figure 22).

Ces enzymes présentent une préférence marquée pour les acides aminés aromatiques et hydrophobes incluant la phénylalanine, le tryptophane, la tyrosine et la leucine. Ces protéines sont des flavoprotéines homodimériques glycosylées. Chaque sous-unité présente trois domaines: (i) un domaine de liaison au cofacteur, (ii) un domaine de liaison au substrat et (iii) un domaine hélicoïdal. Elles possèdent une masse moléculaire allant de 50 à 70 kDa en conditions dénaturantes [Du et al. 2002] et de 110 à 150 kDa à l’état dimérique natif. De plus, les LAAO contiennent jusqu’à 3.7 kDa de sucres par protomère [Geyer et al. 2001].

Les LAAO sont retrouvées largement distribuées depuis les bactéries, les champignons, les algues jusqu’aux mammifères. On les retrouve en particulier dans les venins d’insectes et de serpent dont elles représentent parfois le composant majeur du venin (jusqu’à 30% des protéines totales dans le venin de la vipère C.Rhodostoma. [Ponnudurai et al. 1994]).

D’après Pawelek et al. EMBO. 2000

Figure 22: Représentation schématique du mécanisme d’action des L-amino acid oxydase (LAAO)

Les LAAO dégradent des acides aminés en un intermédiaire imino acide qui sera ensuite métabolisé en l’a-keto acide correspondant et ammonium libérant de l’H2O2.

Les LAAO de sources diverses présentent de nombreuses différences au niveau de leur séquence, spécificité de substrat, stabilité, glycosylation, régulation et activités biologiques. Alors que les LAAO de bactéries, de champignons, et de plantes apparaissent impliquées dans la production d’azote via l’ammoniac, leur rôle physiologique dans le venin de serpent est encore mal connu. Les effets plaquettaires rapportés des différentes LAAO sont encore très controversés. Les LAAO de l’Echis Colorata et du Naja naja kaouthi inhibent l’agrégation plaquettaire humaine induite respectivement par l’ADP ou le stress mécanique [Nathan et al. 1982; Sakurai et al. 2001]. A contrario, les LAAO d’autres serpents tel que l’Eristocophis macmahoni induisent l’agrégation des plaquettes chez l’homme [Ali et al. 2000]. D’autres effets ont également été décrits. En effet, les LAAO de certains venins sont capables d’induire l’apoptose de cellules endothéliales et vasculaires humaines mais également de diverses lignées tumorales humaines ou murines telles que les cellules humaines de leucémie promyélocytaire de la lignée HL-60 [Torii et al. 1997], ou encore les cellules murines de leucémie lymphocytaire de la lignée L1210 [Suhr et al. 1999]. L’effet toxique des LAAO serait essentiellement lié à la production d’ H2O2. L’ajout de catalase qui dégrade l’H2O2, permet de bloquer cet effet.

Des protéines présentant une activité LAAO ont également été décrites chez les poissons. Ainsi, les extraits viscéraux du poisson Chub mackerel sont capables d’induire l’apoptose de cellules tumorales humaines. Le gène codant pour la protéine responsable de cette activité a été cloné. Cette protéine appelée Apoptosis-Inducing Protein (AIP) présente une activité LAAO dirigée contre la L-lysine. AIP est induite seulement après l’infection du poisson par le nématode Anisakis simplex et se localise au niveau de la capsule entourant le nématode afin d’empêcher sa migration dans les tissus environnants de l’hôte [Jung et al. 2000] et joue donc un rôle dans le contrôle de la proliferation d’un pathogène. La protéine AIP peut induire l’apoptose des cellules tumorales humaines par deux mécanismes distincts. Un premier mécanisme implique la production de H2O2 par l’activité LAAO. Le second mécanisme est induit par l’appauvrissement du milieu en L-lysine (principal substrat de AIP) qui active la voie de l’apoptose caspase-9/cytochrome c [Murakawa et al. 2001].

Plus récemment, une LAAO a été mise en évidence dans le lait de la souris à partir du 18^ème jour de gestation et jusqu’à la fin de la lactation. Cette LAAO présente environ 53% d’homologie avec l’apoxine I (LAAO du venin du Western Diamonback Rattlesnake) [Sun et al. 2002]. Une étude biochimique a montré un important rôle antibactérien de cette

LAAO, en particulier dans la prévention de l’infection de la glande mammaire [Nagaoka et al. 2009].

Au cours des dix dernières années, de nombreuses LAAO de serpent ont été purifiées et caractérisées d’un point de vue biochimique. En 2000, l’équipe de A Vrielink publia pour la première fois, une cristallographie aux rayons X à haute résolution de la structure de la LAAO de la vipère Callollesma rhodostoma (C. Rhodostoma), liée au citrate et à l’aminobenzoate, prouvant la structure dimérique de la protéine et indiquant les acides aminés essentiels impliqués dans la liaison au cofacteur FAD (trois résidus : acide glutamique 457, arginine 71, acide glutamique 63) [Pawelek et al. 2000]. Six ans plus tard, un second article de la même équipe montrait une structure cristallographique de la protéine liée à son substrat, la phénylalanine. Cette cristallographique a permis de déterminer que l’acide aminé His223 est impliqué dans l’ouverture du canal H2O2 et la liaison au substrat et que les acides aminés arginine 90, glycine 464 et tyrosine 372 sont impliqués uniquement dans la liaison au substrat [Moustafa et al. 2006]. Ces études ont mis en évidence deux sites de N-glycosylation,:l’asparagine 172 situé dans le domaine hélicoïdal et l’asparagine 361 localisé dans le domaine de liaison au substrat [Pawelek et al. 2000]. Le glycane de ces deux N-glycosylations a été en suite identifié comme étant un dodesaccharide fucosylé, bis-sialylé et biantennaire [Geyer et al. 2001]

Une étude de la structure primaire de l’apoxine I parue en 1998 [Raibekas et al. 1998], a observé 37% d’identité de séquence entre l’apoxine I et une protéine nouvellement décrite : l’Interleukine 4-induced gene 1 (IL4I1) de souris. IL4I1 présente elle-même une homologie de 51% avec la LAAO décrite dans le lait de souris. Cependant, l’étude phylogénétique des séquences protéiques des L-amino-acid oxydases montre une plus forte homologie de séquences entre la protéine IL4I1 des mammifères et les LAAO des poissons dont le poisson zèbre [Hughes 2010].