4.1. Coupe des tiges de maïs
Un tronçon d’environ 1 cm de long est coupé au milieu de chaque entrenœud conservé dans l’éthanol à 70°. Ce tronçon est mis à tremper dans l'eau pendant 1 nuit pour les hydrater. Pour chaque tronçon, 15 coupes de 150 µm d'épaisseur ont été préparées au vibratome (Leica VT1000 S) avec une lame saphir (DDK- Permanent Steel Microtome Knives 160 mm). Cette épaisseur de coupes a été retenue pour minimiser l’observation de couches cellulaires superposées.
4.2. Coloration des coupes de tiges de maïs
Les coupes ainsi réalisées sont colorées pendant toute une nuit par une solution de Fasga diluée au 1/8ème (v/v) dans l'eau distillée. La solution mère de Fasga est composée de 0,05%
safranine O, 0,2% de bleu alcian, 1,5% d'acide acétique et 46% de glycérine dans l'eau distillée. Après coloration, les coupes sont rincées deux fois 5 min avec de l'eau distillée puis montées entre lame et lamelle avec une goutte d’eau. La safranine O est un colorant rouge, basique, cationique, et le bleu alcian est un colorant anionique acide. Comme les lignines sont acides (en raison des groupes hydroxyles phénoliques), les tissus lignifiés sont colorés en rouge. La coloration au Fasga fait donc apparaître les tissus lignifiés en rouge, alors que les tissus non lignifiés ou faiblement lignifiés sont colorés en bleu.
4.3. Acquisition des images
Prise d’image des coupes colorées au Fasga
Les images des coupe colorées au Fasga sont acquises à l’aide d’une loupe (× 1, Nikon SMZ 1000) ou d’un microscope (× 10 Leica DMRB) équipés d’une caméra ProgRes® C10 Plus. La loupe permet d’observer les coupes dans leur intégralité. Les images acquises ont été numérisées sous forme d'images couleur avec une résolution de 10 microns par pixel.
Les images acquises sur les six stades de développement pour le génotype F324 sont présentées dans la figure II-4 pour illustration.
Figure II-4. Images
acquises (x 1) après coloration au Fasga des coupes de 150 µm pour chaque stade de développement. A, 8 feuilles ligulées; B, 10 feuilles ligulées ; C, panicule visible ; D, floraison femelle ; E, 14 jours après floraison femelle et F, stade maturité ensilage.
Prise d’image, des coupes non colorées, à l’échelle macroscopique
un système d’éclairage dont l’intensité est contrôlée, des platines motorisées pour positionner la caméra et les échantillons (Figure II-5). Ce matériel est décrit plus en détails dans Papineau et al. (2008).
Figure II-5. Système d’acquisition d’image BlueBox.
Un anneau de fibres optiques (SCHOTT DCR® IV Light Source) est placé sur un fond noir de manière à rétro-éclairer les coupes avec un angle de 35° environ. La coupe de 150 µm des tiges de maïs non colorées sont déposées dans une boite de pétri placée 5 cm au-dessus du fond noir. Des images monochromes de 1620 × 1220 pixels (taille de pixel : 3.63 µm) dont les niveaux de gris sont codés soit sur 8 bits entre 0 (noir) et 255 (blanc), soit sur 12 bits entre 0 (noir) et 4096 (blanc) sont acquises. L’utilisation des platines motorisées permet d’acquérir des images adjacentes sans rotation de l’échantillon qui peuvent être facilement assemblées sous la forme d’images mosaïques dont un exemple est présenté en figure II-6 pour le génotype F324 au stade S4.
Figure II-6. Example d’images mosaïques d’une coupe de tige de maïs (F324 au stade 4).
Résolution : 3664 × 3888 pixel, soit 1 pixel = 3.63 µm.
4.4. Analyses des images
Analyse granulométrique des images en niveaux de gris acquises sur la BlueBox
L’analyse granulométrique par morphologie mathématique a été développée à l’Ecole des Mines de Paris. Son intérêt pour l’analyse de la taille des cellules de péricarpes de tomate a été montré dans Devaux et al. (Devaux et al., 2008).
Le principe de base de la morphologie mathématique est de transformer l'image au travers d’un masque de géométrie que l'on déplace de façon à ce que son origine passe par toutes les positions de l'image. La taille et la forme de cet élément sont choisies pour mettre en évidence certaines caractéristiques de l'image. Dans le cas des images de tissus végétaux, les cellules apparaissent en sombre et la taille des cellules est analysée en utilisant des fermetures de taille croissante. Après une fermeture, la somme des niveaux de gris dans l’image augmente. Cette
augmentation dépend de la quantité de cellules éliminées. Une courbe granulométrique est calculée comme le pourcentage d’augmentation de la somme des niveaux de gris en fonction de la taille de fermeture. Les courbes granulométriques sont tracées en fonction de la taille de l’élément structurant exprimée en pixel ou en µm. Des procédures d’analyse granulométrique en niveaux de gris ont été développées sous Matlab (V2007a - www.mathworks.fr ) pour s’appliquer à des collections d’images.
Quantification de la distribution des surfaces lignifiées sur coupes colorées au Fasga
A partir des images acquises à la loupe sur les coupes colorées au Fasga, nous avons dans un premier temps déterminé la surface rouge totale représentant la surface de tissus lignifiés. Nous avons dans un second temps développé une méthode d’analyse d’image automatisée pour quantifier la distribution des lignines au sein des coupes. Cette méthode repose sur l’analyse des profils rouge et bleu en fonction de la distance par rapport à l’épiderme. Ce développement fait l’objet d’une publication soumise à « Journal of Agricultural and Food Chemistry » et présentée dans le chapitre IV-2.1. De façon très brève nous avons défini des régions concentriques sur chaque image. Puis nous avons calculé l’intensité moyenne de rouge et de bleu dans chaque région ainsi définie. Ceci nous a permis de décrire la distribution des tissus lignifiés et non lignifiés en fonction de la distance par rapport à l’épiderme. Enfin, nous avons défini le taux de lignification comme étant le rapport d’intensité rouge sur bleu dans les différentes régions. Le profil du rapport intensité rouge sur bleu correspond ainsi au profil de distribution des lignines le long de la coupe et ceci en fonction de la distance à l’épiderme. L’étape ultime de ce développement a consisté à quantifier la lignification dans trois régions spécifiques des coupes : l’épiderme, la moelle et une zone qui sépare les deux précédentes et reste généralement bleue.