Les méthodes d'étude structurale des virus

La structure virale est caractérisée de nos jours par deux techniques essentielle-ment : la diraction des rayons X et les techniques microscopiques.

La cristallographie par rayons X

Les premières études par diraction des rayons X (DRX) de cristaux de virus végétaux comme le TBSV remontent à la n des années 30. Depuis la n des années 80 et la première structure à haute résolution [59], les progrès de l'informatique et des méthodes de traitement des données ont fait que des dizaines de structures de virus végétaux, animaux et d'insectes ont été élucidées avec une résolution quasi-atomique [50]. Mais seules les structures de forme très régulière peuvent former des monocristaux, et l'étude de gros virus ou de virus plus complexes n'est possible que par le biais de substructures de ces virus. La détermination de la structure d'un virus repose non seulement sur l'existence des symétries du cristal mais aussi sur les symétries du virus. Les parties non ordonnées des virus comme certains segments du matériel génétique par exemple ou les parties de la capside interagissant avec le matériel génétique sont invisibles par cristallographie X.

Les techniques microscopiques

La microscopie électronique en transmission La microscopie électronique est un outil formidable pour l'étude de la structure des virus, et encore plus depuis l'avène-ment de la cryomicroscopie électronique (cryo-EM) [60, 19]. La méthode tradition-nelle de coloration négative par des métaux lourds denses aux électrons¹³ (acétate d'uranyle, phosphotungstate de potassium) limite la résolution à environ 50 Å, du fait des inhomogénéités de coloration, de la déshydratation et de l'aplatissement des virus, et des dommages radiatifs causés par les électrons. Néanmoins cette résolution est susante pour avoir une idée précise de la morphologie d'un virus.

La cryomicroscopie électronique améliore grandement les possibilités d'observa-tion de virus et d'autres complexes supramoléculaires. Les échantillons sont conge-lés rapidement dans une couche de glace (vitreuse). L'utilisation de petites doses d'électrons à une température proche de celle de l'azote liquide combinée au déve-loppement de programmes ecaces de traitement d'images permet d'atteindre des résolutions de l'ordre de la dizaine d'angströms et en-deçà. Les gures A.4, A.5 et A.3 montrent quelques exemples de reconstructions tridimensionnelles de virus isométriques faites à partir de clichés de cryo-EM.

La cryomicroscopie électronique ne peut pour l'instant pas rivaliser avec la dif-fraction des rayons X (DRX) dont la résolution est quasi-atomique (1.8 Å pour le STMV par exemple [50]). Elle peut cependant dans bien des cas compléter les don-nées de la DRX d'une part (et même les remplacer dans le cas de structures diciles ou impossibles à cristalliser) et d'autre part permettre l'étude d'échantillons hété-rogènes. Il est possible d'observer par cryo-EM, l'eet d'un changement de pH par exemple, qui a un eet connu sur la structure d'un virus mais ne provoque pas une transition nette de toute la population virale vers un état déni [61]. La cryo-EM constitue donc un outil précieux pour l'observation des changements structuraux à grande échelle dans les virus.

La microscopie à force atomique Depuis une dizaine d'année, une technique d'imagerie supplémentaire a commencé à révéler son utilité dans l'observation et la caractérisation mécanique des structures virales. Inventée par G. Binnig en 1982 [62], la microscopie à force atomique (AFM) est depuis peu utilisée sur des échantillons biologiques et de manière encore plus récente sur des virus [63, 64, 65, 66]. Le prin-cipe de l'AFM peut se résumer de la manière suivante : une pointe extrêmement ne typiquement de Si ou SiN (∼ 1nm) montée sur un levier balaye la surface de l'échantillon. A proximité de l'échantillon les forces qui s'exercent entre la pointe et la surface provoquent la déexion du levier, en général mesurée par réexion d'un spot laser sur le levier vers un réseau de photodiodes. En pratique, une boucle de rétroaction ajuste la distance de la pointe à l'échantillon pour que la force entre les deux soit constante, ce qui évite que la pointe n'entre en collision avec la surface.

On obtient ainsi une image de la topographie de l'échantillon.

L'un des grands avantages de l'AFM par rapport à d'autres techniques est qu'elle

13. utilisée à cause du manque de contraste de la matière organique.

Figure 1.8 Observation du TMV par AFM. Image à deux dimensions (à gauche) et prol tridimensionnel (à droite). On distingue sur ces images les tubes de TMV orientés pour certains parallèlement au plan du substrat et pour les autres quasiment perpendicu-lairement.

peut se faire en phase liquide et en particulier dans des conditions physiologiques, sans perturber l'échantillon. L'AFM permet aussi d'observer individuellement une particule virale avec ses éventuels défauts structuraux, il n'y a pas d'eet de moyenne sur l'échantillon comme pour les reconstructions tridimensionnelles de virus à partir de la cryo-EM ou comme les données issues de la diraction des cristaux. A la diérence du TEM pour laquelle les images obtenues résultent de la projection d'une particule sur un plan, l'AFM donne en outre des images tridimensionnelles de la surface, avec une très bonne résolution en hauteur, qui peut être meilleure que 0,1nm (0,5nm pour les matériaux biologiques). Du fait de la taille nie de la pointe, la taille latérale d'objets isolés peut cependant être légèrement surestimée.

Mais si ces objets forment un assemblage compact, leur dimension latérale peut être calculée en prenant les distances de centre à centre.

Nous avons utilisé l'AFM pour caractériser nos échantillons (gure 1.8). Cela constituait pour nous une solution permettant d'économiser la mise en forme assez longue des échantillons pour les observations en MET.

Une extension de la technique AFM à la nanoindentation a une application inté-ressante sur la détermination des paramètres élastiques de capsides virales [67, 68].

Ce type de mesure a été réalisé récemment sur la capside virale du bactériophage φ29 (virus de bactéries à la morphologie ovoïde complexe) et d'un phytovirus iso-métrique (CCMV, Cowpea Chlorotic Mottle Virus, D = 28nm). Elles ont permis d'évaluer la rigidité des parois virales correspondantes (à des endroits précis dans le cas du phage), à travers la mesure du module d'Young. Le premier résultat de ces travaux est que les capsides virales sont caractérisées par une grande élasticité et la description de ces objets en termes de coque élastique relativement épaisse se révèle

être adaptée. La comparaison entre le CCMV et le bactériophageφ29révèle que les modules d'Young de ces deux coques virales dièrent d'un ordre de grandeur, en accord avec les diérentes pressions internes exercées par le contenu viral (environ 60atm dans le cas du phage). Un autre aspect remarquable révélé par ces mesures est que la stabilité mécanique des capsides peut être signicativement accrue par une modication ponctuelle d'un constituant capsidique (mutation). Bien que nous n'ayons pas étudié les mêmes virus, nous verrons dans le chapitre IV que nos mesures Brillouin sur un cristal de STMV donnent des résultats cohérents avec ces mesures AFM.