3. L’improvisation dans Nyctophilia
3.3 Les improvisations du soliste
Para a comparação dos dois sistemas de cultivo in vitro das MCI após imunocirurgia: MEF ou Matrigel para os dois grupos de embriões: produzidos in vivo e in vitro, foi empregado o teste qui-quadrado, com nível de significância de 5% com
Genes Primers Concentração (nM)
Nanog F 5´– CTGAGGTTTATGGGCCTGAA – 3´ 400 R 5´– TGGGACCTTTTCCTCCTTCT – 3´ 400 Sox2 F 5´– ACATGAATGGCTGGAGCAAC – 3´ 400 R 5´– GCGAGTAGGACATGCTGTAGG – 3´ 200 FoxD3 F 5´– ATCTGCGAGTTCATCAGCAA – 3´ 400 R 5´– CCGTTGTCGAACATGTCCTC – 3´ 400 GAPDH F 5´– TCGGAGTGAACGGATTTG – 3´ 400 R 5´– CCTGGAAGATGGTGATGG – 3´ 400
Quadro 1 - Primers utilizados na verificação da expressão dos genes Nanog, Sox2, FoxD3 e GAPDH (controle endógeno)
46
o software Statistica for Windows. O teste exato de Fisher foi usado quando a freqüência esperada foi menor ou igual a 5.
Para a comparação da expressão dos genes Nanog, Sox2 e FoxD3 entre embriões suínos produzidos in vitro e in vivo foi usado o teste não paramétrico de modo pareado fixo de realocação ao acaso (Pair wise fixed reallocation
randomisation test) utilizando o “Relative Expression Software Tool” (REST; PFAFFL
et al., 2002). O nível de significância adotado foi de 5%. Os dados foram apresentados em escala logarítmica.
47
48
5 RESULTADOS
Embriões suínos foram produzidos in vitro e in vivo com sucesso, embora os índices de produção tenham sido abaixo do esperado.
5.1 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES SUÍNOS
Foram realizadas 48 manipulações para a PIV de embriões suínos. Estas manipulações totalizaram 4495 oócitos maturados e submetidos à FIV. Destes, 902 (20,07%) clivaram e 279 (30,93%) atingiram estágio de blastocisto. Os dados completos sobre as manipulações para PIV em suínos estão na tabela 1.
Tabela 1 - Dados das manipulações para PIV de embriões suínos, incluindo índices de clivagem e de formação de blastocistos – São Paulo – 2009
(Continua) Manipulação Data da MIV Oócitos Fecundados Clivados Índice de Clivagem (%) Blastocistos Índice de Blastocisto (%) sobre oócitos Índice de Blastocisto (%) sobre clivados 1 12/03/07 125 0 0 0 0 0 2 26/03/07 115 0 0 0 0 0 3 17/04/07 81 9 11,11 0 0 0 4 23/04/07 86 41 47,67 31 36,05 75,6 5 07/05/07 148 37 25,00 7 4,73 18,91 6 15/05/07 113 67 59,29 33 29,20 49,25 7 21/05/07 54 32 59,26 7 12,96 21,86 8 12/06/07 101 6 5,94 1 0,99 16,67 9 10/07/07 20 9 45,00 0 0 0 10 16/07/07 93 0 0 0 0 0 11 25/07/07 80 0 0 0 0 0 12 28/08/07 107 8 7,48 0 0 0 13 03/09/07 119 não avaliado não avaliado 6 5,04 14 11/09/07 78 8 10,26 1 1,28 12,50 15 12/09/07 66 23 34,85 8 12,12 34,78
49
Parte dos blastocistos obtidos foi utilizada também em outro estudo, realizado por Goissis (2008).
Tabela 1- Dados das manipulações para PIV de embriões suínos, incluindo índices de clivagem e de formação de blastocistos – São Paulo – 2009
(Conclusão) Manipulação Data da MIV Oócitos Fecundad os Clivados Índice de Clivagem (%) Blastocistos Índice de Blastocisto (%) sobre oócitos Índice de Blastocisto (%) sobre clivados 16 17/09/07 90 0 0 0 0 0 17 24/09/07 116 não avaliado não avaliado 3 2,59 18 15/10/07 88 0 0 0 0 0 19 16/10/07 151 43 28,48 8 5,30 18,60 20 22/10/07 162 5 3,09 0 0 0 21 30/10/07 80 5 6,25 0 0 0 22 19/11/07 48 4 8,33 0 0 0 23 26/11/07 65 0 0 0 0 0 24 03/12/07 74 6 8,11 1 1,35 16,67 25 11/12/07 56 28 50,00 5 8,93 17,86 26 12/12/07 60 0 0 0 0 0 27 08/01/08 114 19 16,67 4 3,51 21,05 28 09/01/08 47 9 19,15 0 0 0 29 19/02/2008 99 33 33,33 5 5,05 15,15 30 25/02/2008 73 30 41,10 17 23,29 56,67 31 03/03/2008 90 36 40,00 1 1,11 2,78 32 17/03/2008 111 62 55,86 28 25,23 45,16 18 6 33,33 3 16,67 50,00 33 18/03/2008 99 29 29,29 6 6,06 20,69 34 24/03/2008 67 7 10,45 0 0,00 0,00 13 2 15,38 0 0,00 0,00 35 05/05/2008 93 13 13,98 0 0,00 0,00 36 12/05/2008 130 0 0,00 0 0,00 0,00 37 19/05/2008 71 13 18,31 2 2,82 15,38 38 26/05/2008 94 26 27,66 5 5,32 19,23 39 09/06/2008 100 27 27,00 3 3,00 11,11 40 16/06/2008 137 32 23,36 5 3,65 15,63 41 17/06/2008 112 40 35,71 17 15,18 42,50 42 14/07/2008 84 19 22,62 8 9,52 42,11 43 21/07/2008 140 41 29,29 17 12,14 41,46 44 28/07/2008 76 25 32,89 15 19,74 60,00 45 29/07/2008 87 19 21,84 9 10,34 47,37 46 06/08/2008 120 47 39,17 17 14,17 36,17 47 11/08/2008 70 36 51,43 6 8,57 16,67 48 22/09/2008 74 0 0,00 0 0,00 0,00 Total 4495 902 20,07 279 6,21 30,93
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5.2 COLHEITA DE EMBRIÕES SUÍNOS PRODUZIDOS IN VIVO
Foram realizadas colheitas de embriões suínos em dois períodos: Janeiro de 2008 (8 colheitas) e Setembro a Novembro de 2008 (4 colheitas).
5.2.1 Colheitas realizadas em Janeiro de 2008
Num total de 8 colheitas, 246 blastocistos viáveis foram recuperados. O resumo das colheitas encontra-se na tabela 2. Destes, 239 sobreviveram ao transporte e foram distribuídos de acordo com a tabela 3.
Tabela 2 - Colheitas de embriões suínos produzidos in vivo durante o mês de Janeiro de 2008 – São Paulo – 2008
Colheita
Estágio Embrionário 1 2 3 4 5 6 7 8 Total
Não fecundados 55 5 1 61 Mórula Compacta 3 5 8 BL Inicial 1 4 5 BL 1 1 18 15 35 BL Expandido 8 6 1 49 64 BL Expandido Retraído 17 2 15 10 44 BL Eclodido Inicial 4 4 BL Eclodido Tardio 16 40 4 30 4 94 Degenerados 14 45 87 20 84 92 342
Total por coleta 31 55 111 107 60 38 84 171 657
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Assim como os embriões produzidos in vitro, uma parte dos blastocistos foi utilizada em outro estudo, realizado por Goissis (2008). Os embriões destinados à imunocitoquímica estão armazenados em solução de polivinilpirrolidona (PVP) em PBS para futura análise.
5.2.2 Colheitas realizadas em Setembro, Outubro e Novembro de 2008
De um total de 4 colheitas, foram recuperados 76 blastocistos (Tabela 4). Os blastocistos foram distribuídos de acordo com a tabela 5.
onde: BL= blastocisto
Tabela 3 - Distribuição dos blastocistos suínos produzidos in vivo colhidos durante o mês de Janeiro de 2008 – São Paulo – 2008
Coleta
1 2 3 4 5 6 7 8 Total
Imunocirurgia e cultivo 5 10 12 6 8 12 53
PCR em tempo real 6 31 21 19 45 122
Imunocitoquímica 5 12 5 10 10 22 64
Total por coleta 16 53 17 37 37 79 239
Tabela 4 - Colheitas de embriões suínos produzidos in vivo durante os meses de Setembro, Outubro e Novembro de 2008 – São Paulo – 2008
Colheita
Estágio Embrionário 1 2 3 4 Total
Não fecundados 6 5 33 44 Mórula Compacta 1 1 BL Inicial 1 1 BL 3 1 3 7 BL Expandido 4 4 BL Expandido Retraído 39 6 2 13 60 BL Eclodido Inicial 4 4 BL Eclodido Tardio Degenerados 4 9 11 24
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Tabela 5 - Distribuição dos blastocistos suínos produzidos in vivo coletados durante os meses de Setembro, Outubro e Novembro de 2008 – São Paulo – 2008 Colheita 1 2 3 4 Total Imunocirurgia e cultivo 17 3 5 25 PCR em tempo real 30 11 41 Imunocitoquímica 10 10
Total por coleta 47 10 3 16 76
Os embriões destinados à imunocitoquímica estão armazenados em solução de PVP em PBS para futura análise.
5.3 CULTURA DE CTE SUÍNAS
5.3.1 Imunocirurgia
A avaliação morfológica sob estereomicroscopia sugere que a imunocirurgia não removeu completamente o trofoectoderma dos blastocistos (Figura 3). Nas imagens D e E da figura 3 é possível observar que mesmo após o término da imunocirurgia, ainda foi possível visualizar o trofoectoderma dos blastocistos.
53
Figura 3 – Blastocistos suínos produzidos in vivo durante procedimento de imunocirurgia (A- E; aumento de 40 x - A, B, C e E; aumento de 60 x - D). Blastocistos com zona pelúcida (A); blastocistos após digestão da zona pelúcida com solução de pronase (B); blastocistos após incubação com soro anti-suíno por 1 h (C); blastocistos após incubação com complemento de cobaia por 1 h (D) e blastocistos cultivados sobre monocamada de MEF, dia 0 do cultivo (E)
Na tabela 6 estão apresentados os resultados de MCI isoladas de embriões suínos produzidos in vivo e in vitro por imunocirurgia cultivadas em MEF, enquanto na tabela 7 estão os resultados do cultivo realizado em Matrigel. De 10 MCI provenientes de embriões produzidos in vitro que foram cultivadas em MEF, somente 3 aderiram à monocamada de células murinas, enquanto nenhuma MCI interna aderiu ao Matrigel das 4 cultivadas. Quanto às MCI oriundas de embriões produzidos in vivo, 27 das 50 cultivadas em MEF aderiram, enquanto somente 3 de 16 aderiram ao Matrigel. Contudo, não houve diferença entre os sistemas de cultivo MEF e Matrigel na aderência das MCI. Também não houve diferença entre os dois grupos de embriões: in vitro e in vivo (p>0,05).
As MCI que aderiram ao MEF foram subcultivadas em MEF ou Matrigel após a 1ª derivação (Tabela 6). As MCI que aderiram ao Matrigel foram subcultivadas em Matrigel (Tabela 7). Nenhuma colônia foi obtida em ambos os sistemas de cultivo.
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Tabela 6 - Cultivo em MEF de MCI oriundas de blastocistos suínos submetidos à imunocirurgia – São Paulo – 2008
Número de MCI cultivadas
Número de colônias após 1ª derivação
Sistema de Produção
dos Embriões Total Aderidas MEF Matrigel
In vitro 10 3 0 0
In vivo 50 27 0 0
Tabela 7 - Cultivo em Matrigel de MCI oriundas de blastocistos suínos submetidos à imunocirurgia – São Paulo – 2008
Número de MCI cultivadas
Número de colônias Sistema de Produção
dos Embriões Total Aderidas Matrigel
In vitro 4 0 0
In vivo 16 3 0
A Figura 4 ilustra MCI aderidas ao MEF quatro dias após a imunocirurgia de 3 blastocistos suínos produzidos in vivo.
Figura 4 – MCI 4 dias após imunocirurgia sobre monocamada de MEF. (A) MCI não aderida; (B) MCI aderida. Aumento de 200 x.
55
5.4 CARACTERIZAÇÃO
5.4.1 PCR em tempo real
Foi identificada a expressão dos genes Nanog, Sox2 e FoxD3 nos blastocistos suínos produzidos in vitro e in vivo (Figuras 5-7).
Figura 5 – Verificação da expressão e curva de dissociação do marcador de pluripotência Nanog em blastocistos suínos produzidos in vitro (vermelho) e in vivo (preto) por PCR em tempo real.
56
Figura 6 – Verificação da expressão e curva de dissociação do marcador de pluripotência Sox2 em blastocistos suínos produzidos in vitro (vermelho) e in vivo (preto) por PCR em tempo real.
57
Figura 7 – Verificação da expressão e curva de dissociação do marcador de pluripotência FoxD3 em blastocistos suínos produzidos in vitro (vermelho) e in vivo (preto) por PCR em tempo real.
A figura 8 mostra a expressão de Nanog, Sox2 e FoxD3 nos blastocistos produzidos in vitro em relação à expressão observada nos blastocistos produzidos in
vivo. A comparação da expressão desses genes revelou que não houve diferença no
padrão de expressão do gene FoxD3 entre os grupos testados. Contudo, observou- se que blastocistos produzidos in vitro apresentaram uma menor expressão dos genes Nanog e Sox2 em relação aos blastocistos produzidos in vivo (p< 0,05; Tabela 8).
58
Figura 8 – Expressão dos genes Nanog, Sox2 e FoxD3 em blastocistos suínos produzidos in vitro em relação aos embriões produzidos in vivo. A razão da expressão gênica é dada em escala logarítmica.
Na tabela 8 estão apresentados os dados da análise da expressão gênica de Nanog, Sox2 e FoxD3 em blastocistos produzidos in vivo e in vitro.
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Tabela 8 - Análise da expressão gênica de Nanog, Sox2 e FoxD3 em blastocistos suínos produzidos in vitro e in vitro – São Paulo – 2008
GAPDH Nanog Sox2 FoxD3
Eficiência PCR 2,10 2,07 2,06 1,91
Médias In vitro (ct) 30,05 29,72 30,46 36,90
Médias In vivo (ct) 30,02 33,68 32,64 36,87
Valor de P 0,001 0,027 0,966
60
61
6 DISCUSSÃO
Embora linhagens de já CTE-like tenham sido isoladas a partir de embriões pré-implantação em suínos (SHIM et al., 1997; CHEN et al., 1999; LI et al., 2003), poucos resultados foram obtidos com embriões produzidos in vitro até o momento. Miyoshi et al. (2000) isolaram CTE-like de embriões suínos produzidos in vitro após o cultivo dos embriões intactos, ou seja, que não foram submetidos ao isolamento da MCI. Li et al. (2004b) também cultivaram embriões suínos produzidos in vitro intactos. A linhagem obtida foi descrita como CTE-like, que se apresentou positiva para fosfatase alcalina, que é comumente expressa em células pluripotentes. Contudo, até momento não foram obtidas CTE suínas que apresentem todos os requisitos necessários para serem caracterizadas como CTE legítimas. O presente trabalho buscou o estabelecimento de uma linhagem de CTE a partir de embriões suínos produzidos in vitro e in vivo. Para tal, embriões em estágio de blastocisto foram submetidos à remoção do trofoectoderma por imunocirurgia. A MCI resultante foi cultivada sobre monocamada de MEF ou Matrigel. Embora tenha sido observada a adesão da MCI nos dois sistemas de cultivo, nenhuma colônia de CTE foi obtida após as derivações. Assim, a hipótese que CTE cultivadas in vitro apresentam expressão dos genes Nanog, FoxD3 e Sox2 similares às observadas nas células da MCI não pôde ser testada.
Contudo, foi possível comparar os dois sistemas de cultivo in vitro das MCI isoladas, MEF e Matrigel, quanto à adesão dessas MCI. Os dois sistemas mostraram-se eficientes em suportar o cultivo dessas MCI até a primeira derivação, realizada 4 dias após o início do cultivo. Mesmo assim, não foi possível comparar a eficiência dos dois sistemas de cultivo na obtenção de colônias de CTE suínas, visto que nenhuma colônia foi obtida.
A capacidade da linhagem de MEF e da monocamada de Matrigel utilizados neste estudo em servir de co-cultivo para CTE foi anteriormente averiguada por Goissis (2008). Através do cultivo de CTE murinas da linhagem USP11, Goissis verificou que os dois sistemas são capazes de suportar o cultivo in vitro de CTE.
1
CTE murinas da linhagem USP1 foram gentilmente cedidas pela Dra. Irina Kerkis, pesquisadora do Instituto Butantan de São Paulo
62
Durante o procedimento de imunocirurgia, observou-se que a MCI resultante tornou-se mais enegrecida. Muitas vezes o embrião se desfez durante a incubação com o complemento de cobaia. Contudo, é difícil supor que a imunocirurgia possa ter causado algum dano nos blastocistos, visto que os anticorpos usados nesta técnica são amplamente utilizados em coloração diferencial de embriões suínos (MACHATY; DAY; PRATHER; 1998). Além disso, em algumas manipulações, foi difícil distinguir apenas com o uso do estereomicroscópio onde estava a MCI do embrião. Segundo Li et al. (2003), a difícil visualização da MCI de embriões suínos produzidos in vitro dificulta o seu isolamento, levando à baixas taxas de sucesso. Li et al. (2003) propuseram um novo método para isolar MCI de embriões suínos produzidos in vivo que utiliza uma digestão enzimática com solução de 0,25% de tripsina e 0,04% de EDTA. Seus resultados demonstraram que tal procedimento foi mais eficiente que cultivar embriões intactos, ou seja, que só tiveram a zona pelúcida removida. Li et al. (2004b) isolaram CTE-like de embriões suínos produzidos in vitro apenas cultivando blastocistos sem zona pelúcida pois, segundo esses autores, a imunocirurgia não é a técnica mais adequada para embriões suínos produzidos in vitro devido ao baixo número de células presentes na MCI destes blastocistos.
Diante do exposto sobre técnicas já utilizadas para isolar CTE de suínos, é possível verificar que nenhuma delas até o momento foi considerada totalmente efetiva, visto que somente células semelhantes à CTE foram obtidas. Além disso, o espaço amostral da maioria dos trabalhos é extremamente variável, deixando mais dúvidas sobre o quanto estamos perto de obter tais células na espécie suína. Enquanto Li et al. (2004b) cultivaram 12 blastocistos produzidos in vitro intactos (sem zona pelúcida), dos quais 9 aderiram no MEF e 2 colônias primárias de CTE- like foram obtidas; Kim et al. (2007) submeteram 127 blastocistos produzidos in vitro à imunocirurgia, obtendo 87 MCI aderidas e 32 colônias primárias de CTE-like. Miyoshi et al. (2000) cultivaram 32 blastocistos suínos produzidos in vitro intactos (sem zona pelúcida) e obtiveram 24 MCI aderidas e 9 colônias de CTE-like. Tal variação somente ressalta a elevada inconstância dos resultados da produção in
vitro de embriões na espécie suína. Tal inconstância também foi observada no
presente trabalho. Além disso, o mesmo quadro é observado nas tentativas de isolamento de CTE suínas a partir de embriões colhidos in vivo. Li et al. (2004a) obtiveram 19 colônias de CTE-like derivadas de 25 MCI aderidas, isoladas de um
63
total de 40 blastocistos suínos produzidos in vivo. Chen et al. (1999) isolaram MCI de 196 embriões produzidos in vivo em diferentes estágios pré-implantação. Obtiveram 129 MCI aderidas, 94 culturas primárias e 12 linhagens de CTE-like. Assim, cabe dizer que uma padronização do procedimento de imunocirurgia e das demais técnicas de isolamento da MCI de embriões suínos ainda é necessária para resultados mais efetivos.
Segundo Notarianni et al. (1991), uma possível explicação do porque ainda não se obtiveram linhagens de CTE suínas, se deve ao extenso período de pré- implantação, caracterizado por uma elongação pronunciada do blastocisto e quiescência simultânea da MCI. Chen et al. (1999) realizaram experimentos para verificar qual estágio pré-implantacional de embriões produzidos in vivo é o mais adequado para o isolamento de CTE suínas. Os embriões foram cultivados intactos ou foram submetidos à imunocirurgia para isolamento da MCI. Como co-cultivo foram utilizadas células STO. Concluíram que blastocistos recém eclodidos, colhidos 7-8 dias após inseminação, oferecem os melhores resultados.
O presente estudo também objetivou comparar a expressão gênica dos marcadores de pluripotência Nanog, Sox2 e FoxD3 nos dois grupos de embriões: produzidos in vivo e in vitro, com a finalidade de verificar se existe diferença no padrão de expressão entre os dois grupos. Foi observado que blastocistos suínos produzidos in vivo apresentam maior expressão de Nanog do que blastocistos obtidos por FIV. Tal observação colabora com o reportado por Kumar et al. (2007) e Magnani et al. (2008). O presente estudo também demonstrou uma menor expressão do gene Sox2 em embriões produzidos in vitro quando comparados com embriões produzidos in vivo. Essa diferença já havia sido reportada por Magnani et al. (2008). Contudo, vale ressaltar que o gene endógeno (GAPDH) utilizado para normalizar as análises da expressão gênica no presente estudo é diferente dos utilizados anteriormente, assim como as condições in vitro de produção de embriões.
Segundo estudo realizado por Kuijk et al. (2007), onde diversos genes endógenos foram comparados para realização da análise de expressão gênica de embriões suínos, o GAPDH é um excelente controle endógeno. Kumar et al. (2007) utilizaram o gene da histona H2a como gene endógeno enquanto Magnani et al. (2008), por sua vez, usou o gene YWHAG. Kuijk et al. (2007) desencorajou o uso da histona H2a como controle, por apresentar expressão variável ao longo do desenvolvimento embrionário, não oferecendo, assim, um bom controle endógeno.
64
Sabe-se que embriões produzidos in vitro possuem menor competência de desenvolvimento do que embriões produzidos in vivo. Assim, as condições de cultivo
in vitro são essenciais para uma melhor competência de desenvolvimento
embrionário. O meio NCSU23 (North Caroline State University media) é o mais comumente utilizado na produção in vitro de embriões suínos. Apesar de não ser tão eficiente quanto às condições fisiológicas, este meio oferece altos índices de blastocistos. Ultimamente o meio de cultivo de embriões suínos PZM3 tem sido muito utilizado. Ele é baseado em elementos inorgânicos e substratos energéticos do fluido do oviduto de suínos suplementado com aminoácidos, podendo ser uma alternativa para o desenvolvimento de embriões até o estágio de blastocisto (YOSHIOKA et al., 2002). Kumar et al. (2007) utilizou o meio NCSU23. O cultivo in
vitro de embriões no presente estudo foi feito com o meio PZM3, assim como em
Magnani et al. (2008). Portanto, pode-se dizer que foi observada uma menor expressão dos genes Nanog em blastocistos produzidos in vitro independente do meio de cultivo utilizado.
O presente estudo demonstrou a expressão do gene FoxD3 em embriões suínos. Ainda, foi observado que a expressão desse gene não diferiu entre os dois grupos de blastocistos. A autora do presente trabalho desconhece estudos na literatura que tenham demonstrado a amplificação do gene FoxD3 por PCR em tempo real em embriões suínos. Hanna et al. (2002) demonstraram que a expressão deste gene é necessária para a manutenção de CTE murinas in vitro. No mesmo trabalho, os autores observaram que células da MCI que não expressam FoxD3 param de se proliferar quando cultivadas in vitro, sugerindo que a ausência da expressão deste gene cause a morte dessas células in vitro. Liu et al. (2008) sugerem que FoxD3 esteja envolvido na sobrevivência e auto-renovação de CTE murinas, reprimindo a diferenciação celular. Embora já se tenha observado a sua importância na manutenção da pluripotência de CTE humanas e murinas, não existem na literatura estudos desse marcador de pluripotência em suínos. Sendo assim, mais estudos são necessários para entendermos o papel do FoxD3 na regulação da pluripotência de CTE embrionárias suínas.
Embora dados interessantes tenham sido obtidos no presente trabalho, no que diz respeito à expressão dos marcadores de pluripotência Nanog, Sox2 e FoxD3 em embriões suínos produzidos in vivo e in vitro; um estudo sobre a localização desses fatores nesses embriões, por reação de imunofluorescência, será de grande
65
interesse para complementar esses dados. Ainda, um seqüenciamento do fragmento amplificado por reação de PCR em tempo real correspondente ao gene FoxD3 será interessante para verificar a identidade deste fragmento com a espécie suína.
66
67
7 CONCLUSÕES
Embora não tenha sido possível testar a hipótese que CTE suínas apresentam o mesmo padrão de expressão dos genes Nanog, Sox2 e FoxD3 de MCI de embriões produzidos in vivo e in vitro, foi possível verificar a expressão desses três marcadores de pluripotência em embriões suínos de duas origens diferentes.
Ainda, foi possível observar que blastocistos suínos produzidos in vivo possuem uma maior expressão dos genes Nanog e Sox2. Visto que tais fatores de transcrição são atualmente considerados indispensáveis para a manutenção da pluripotência de CTE in vitro, é possível supor que a primeira colônia de CTE suínas legítima venha a ser obtida de embriões produzidos in vivo.
O presente trabalho demonstrou pela primeira vez, a expressão do gene FoxD3 em blastocistos suínos. Curiosamente, a expressão deste marcador de pluripotência, consagrado nas espécies murina e humana, foi semelhante nos dois grupos de blastocistos. Contudo, pouco se sabe sobre o seu papel na regulação da pluripotência de CTE suínas.
Dessa forma, mais estudos são necessários para estabelecer protocolos eficazes para o isolamento de CTE suínas, assim como esclarecer o papel dos fatores de transcrição Nanog, Sox2 e FoxD3 na regulação da pluripotência de CTE suínas.
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REFERÊNCIAS
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