Les guerres israélo-arabes 1°) le conflit de 1948

A plataforma SOLiD (sequenciação por ligação e deteção de oligonucleótidos), assim como

a sequenciação de Sanger, é baseada na deteção de sinais de fluorescência sendo que uma das diferenças entre ambas é que na sequenciação de Sanger um fluoróforo é utilizado por cada nucleótido e na sequenciação SOLiD um fluoróforo é utilizado para uma determinada combinação de dois nucleótidos. Isto é, cada sinal de fluorescência representa a ligação de dois nucleótidos. Assim, os dados obtidos não podem ser traduzidos numa sequência de nucleótidos conhecida,

Figura 15: Plataforma Ion Torrent. Quando uma base é incorporada, um único ião H + é libertado sendo detetado por

um sensor CMOS-ISFET. Apenas um tipo de dNTPs está presente durante cada ciclo; vários dNTPs idênticos podem ser incorporados durante um ciclo, aumentando os iões libertados. Adaptado de Goodwin, McPherson and McCombie, 2016.

porque cada um dos quatro sinais refere-se a um subconjunto de quatro combinações possíveis de nucleotídeos (Garrido-Cardenas et al., 2017).

O processo de sequenciação começa com a ligação dos fragmentos de DNA a adaptadores sendo de seguida ligados a beads e amplificados por PCR de emulsão. As beads com o DNA

template amplificado são imobilizadas numa flow cell e a sequenciação inicia-se com a ligação de

um primer complementar ao adaptador presente no template (Figura 16). Esta metodologia baseia- se na ligação sequencial de sondas fluorescentes (Valouev et al., 2008). Cada sonda é um octâmero, que consiste em (na direção 3’ para 5’) 2 bases específicas da sonda, seguidas por 6 bases degeneradas (nnnzzz) com um dos 4 fluoróforos existentes ligados à extremidade 5’. As 2 bases específicas da sonda consistem numa das 16 combinações possíveis de 2 bases (Figura 16-A), sendo possível, no fim, determinar qual nucleótido ocupa cada posição graças à técnica conhecida por color-space coding (Li and Homer, 2010). Assim, primeiramente ocorre a ligação de uma sonda adjacente ao primer que se encontra na posição n. Após esta ligação o fluoróforo emite sinal para, de seguida, ser clivado juntamente com as 3 base adjacentes a ele. A extremidade 5’ da sonda clivada é fosforilada antes da ligação da próxima sonda. Ao fim de 7 etapas de ligação de sondas, ou seja, ao fim de um ciclo, a cadeia sintetizada é desnaturada e um novo primer é ligado à cadeia

template, no entanto, na posição n-1 (Figura 16-B). No total, 5 ciclos são realizados e em cada um o primer é ligado numa posição atrás (n-2; n-3; n-4) (Salmela, 2010). No final, a sequência é inferida pela interpretação dos resultados da ligação das 16 possíveis sondas. Com o uso de primers em posições diferentes em cada ciclo, várias bases do adaptador são sequenciadas. Essas informações fornecem um ponto de partida de referência da sequência que é usado em conjunto com a técnica color-space coding para descodificar, algoritmicamente, a sequência downstream do adaptador (Voelkerding, Dames and Durtschi, 2009).

A

B

Figura 16: Uso da técnica color-space coding na determinação da ordem dos nucleótidos por ligação sequencial de

sondas fluorescentes. (A) Cada sonda é um octâmero, que consiste em (na direção 3’ para 5’) 2 bases específicas da sonda, seguidas por 6 bases degenera degeneradas (nnnzzz) com um dos 4 fluoróforos existentes ligados à extremidade 5’. As 2 bases específicas da sonda consistem numa das 16 combinações possíveis de 2 bases. (B) Ao adaptador P1 e ao template com o primer (n) são ligadas sondas representando as 16 combinações possíveis de 2 bases. Neste exemplo, as duas bases específicas complementares ao template são AT. Após o annealing e a ligação da sonda, a fluorescência é registada antes da clivagem das últimas 3 bases da sonda degenerada. A extremidade 5’ da sonda clivada é fosforilada (não mostrada) antes da ligação da próxima sonda. Annealing e ligação da próxima sonda. Extensão completa do primer (n) até ao primeiro ciclo consistido por 7 ciclos de ligação. A nova cadeia, a partir do

primer (n), é desnaturada a partir do adaptador/template e o segundo ciclo de sequenciação é realizado com o primer

A plataforma Complete Genomics (CG), criada em 2006, utiliza uma variação desta última técnica. As duas novidades que esta plataforma apresentou em relação às outras plataformas na altura existentes foram o uso de nanoesferas de DNA (DNBs) e a técnica de ligação que ocorre por

combinatorial probes anchor ligation, cPAL (Garrido-Cardenas et al., 2017).

Na formação das DNBs, o DNA é fragmentado e ligado ao primeiro de quatro adaptadores. O template é amplificado, circularizado e clivado por uma endonuclease tipo II. O segundo adaptador é adicionado, seguido pela amplificação, circularização e clivagem. Este processo é repetido para os dois restantes adaptadores. O produto final é um template circular com quatro adaptadores, cada um separado por uma sequência template. As bibliotecas moleculares passam por uma etapa de amplificação por rolling circle formando as nanoesferas de DNA, que são depois depositadas na flow cell (Goodwin, McPherson and McCombie, 2016).

Depois da deposição das DNBs, uma âncora, complementar a um dos adaptadores, e uma sonda marcada com um fluoróforo são ligadas a cada DNB. As bases que formam a sonda são degeneradas exceto a que se encontra na primeira posição. A âncora e a sonda são então ligadas na posição é capturada a imagem para identificar a primeira base na extremidade 3’ ou na 5’ da âncora. De seguida, o complexo sonda-âncora é removido e o processo recomeça com a mesma âncora, mas uma sonda diferente em que a base conhecida se encontra na posição n+1. Isto repete-se até que cinco bases da extremidade 3’ da âncora e cinco bases da extremidade 5’ da âncora sejam identificadas. Outro ciclo de hibridação ocorre, desta vez, usando âncoras com um deslocamento de 5 bases de distância do primeiro ciclo, identificando cindo bases adicionais de cada lado da âncora. Finalmente, todo este processo é repetido para cada um dos restantes adaptadores na DNB, formando pair-end reads de 100bp (Goodwin, McPherson and McCombie, 2016; Garrido- Cardenas et al., 2017).