Les facteurs d’adhésion - Les facteurs de virulence

C. Les facteurs de virulence

C.1. Les facteurs d’adhésion

I.2.7.1. Transformação com aplicação de lipossomas e CaCl

/PEG

Os protoplastos foram lavados com 10 ml de solução MTC (ver composição na Tabela I.5), contados e depois centrifugados a 2000 g durante 10 min. O pellet foi ressuspenso em MTC de forma a atingir uma concentração de 107 células/600 µl.

Tabela I.5: Composição das soluções MTC. Composição das soluções MTC

MTC – 10 MTC - 20 MTC - 50 Manitol 1,0 M Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 CaCl2 10 mM Manitol 1,0 M Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 CaCl2 20 mM Manitol 1,0 M Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 CaCl2 50 mM

Num tubo Eppendorf, 30 µg de DNA (constituídos por um único tipo de plasmídeo ou constituídos por 15 µg de cada um dos plasmídeos nos casos de co-transformação, conforme indicado na Tabela I.6) foram incubados com um agente de transfecção (ver Tabela I.7), num volume máximo de 60 µl, durante 10 min. Esta mistura foi, em seguida, adicionada delicadamente a 600 µl da suspensão de protoplastos e novamente incubada durante 10 min. Foram adicionados, de um modo suave e lento, 600 µl de uma solução PEG 6000/MTC-20 (ver composição na Tabela I.8) e a mistura foi incubada durante 10 min. Foram adicionados 8,8 ml de uma solução de manitol (1 M)/meio V8C (4/1) e a cultura foi incubada em posição horizontal durante ≈ 16 horas, a 25ºC, no escuro.

Transformação genética de Phytophthora cinnamomi

e silenciamento dos genes das elicitinas Material e Métodos

A cultura foi centrifugada a 3400 g, durante 30 min. O sobrenadante foi eliminado e o

pellet ressuspenso em 500 µl de uma solução de manitol (1 M) / meio V8C (4/1). A suspensão

foi plaqueada em meio V8Ca com higromicina B (250 µg/ml). Esperou-se o aparecimento de

transformantes durante um período máximo de 10 dias após o ensaio.

Estes ensaios foram efectuados pelo menos duas vezes com cada um dos isolamentos seleccionados.

Tabela I.6: Plasmídeos utilizados nos ensaios de transformação. Tipo de Plasmídeo Forma do Plasmídeo

Linearizado pHAMT35H Não linearizado Linearizado pTH210 Não linearizado Linearizado pHAMT35-fatss + pHAMT35H Não linearizado Linearizado pFatssinc Não linearizado Linearizado pHAMT35–shatss + pHAMT35H Não linearizado Linearizado pShAtssInc Não linearizado

Tabela I.7: Agentes de transfecção testados na transformação. Agente de transfecção

100 µg de Escort a _{(Sigma) / 30 µg de DNA plasmídico}

40 µg de Fugene 6 a_{(Boehringer-Mannheim) / 30 µg de DNA plasmídico}

40 µg de Lipofectin a_{(Life-Technologies) / 30 µg de DNA plasmídico}

60 µg de DNA de esperma de arenque (Life-Technologies) / 30 µg de DNA plasmídico

(a) Lipossoma catiónico

Tabela I.8: Composição das soluções PEG 6000. Composição das soluções PEG 6000

PEG 6000/MTC-20 - A PEG 6000/MTC-20 - B PEG 6000 40%(p/v) Manitol 1,0 M Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 CaCl2 20 mM PEG 6000 50%(p/v) Manitol 1,0 M Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 CaCl2, 20 mM

I.2.7.2. Transformação com aplicação de electroporação

Foram realizados vários ensaios de transformação com um aparelho electroporador

Gene Pulser (BIORAD). As células usadas para a transformação foram protoplastos sujeitos a

um de dois tratamentos alternativos:

- O pellet de protoplastos foi ressuspenso em tampão de electroporação a 20°C, lavado e preparado para electroporação;

- O pellet de protoplastos foi ressuspenso numa solução de manitol 1,0 M / meio V8C (4/1) e os protoplastos foram regenerados durante 16 h, a 25ºC, no escuro. Após a incubação foram recolhidos por centrifugação a 2800 g durante 15 min, lavados com tampão de electroporação a 20°C e preparados para electroporação.

Um resumo das condições testadas é apresentado na Tabela I.9.

Os tampões de electroporação utilizados foram uma solução MTC-20 (manitol 1 M;

Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; CaCl2 20 mM), uma solução de Petri modificada (CaCl2 0,25 mM;

MgSO4 1 mM; KH2PO4 1 mM; KCl 0,8 mM) ou uma solução de HEPES 1mM, manitol 50 mM.

Os protoplastos (regenerados ou não) foram ressuspensos em 1200 µl de tampão de electroporação a 4ºC. Uma alíquota de 300 µl foi colocada na cuvette (previamente esterilizada por irradiação UV e arrefecida a 4ºC), bem como 10 µg de DNA plasmídico, sob a forma circular ou linearizada por digestão com HindIII. Após a aplicação do impulso eléctrico, a suspensão foi arrefecida durante 10 min em gelo. Foi adicionado 1 ml de uma solução de manitol 1,0 M / meio V8C (4/1) e a mistura foi transferida para um tubo Eppendorf de 2 ml e incubada a 25ºC. A recuperação imposta às células electroporadas antes de ser exercida pressão de selecção também foi testada em dois períodos: 3 ou 16 h. Após o período de recuperação, as células electroporadas foram plaqueadas em meio selectivo (V8Ca com 250 µg/ml de higromicina B). Esperou-se o aparecimento de transformantes durante um período até 10 dias após o ensaio.

Transformação genética de Phytophthora cinnamomi

e silenciamento dos genes das elicitinas Material e Métodos

Tabela I.9: Resumo das condições aplicadas nos ensaios de electroporação (decaimento exponencial). O DNA plasmídico usado nestes ensaios foi uma combinação de pHAMT35H e pHAMT35-fatss. Cada um destes

ensaios foi repetido pelo menos duas vezes para os isolamentos PA45 e PA37. Capacitância em todos os ensaios: 50 µF.

Tampão de Electroporação Intensidade _PlasmídeoForma do

MTC-20 Petri modificada HEPES/manitol Protoplastos Protoplastos Protoplastos

Linearizado