1.3. Les critères d'élaboration des tests objectifs

As características químicas e aminoacídicas dos glútens vitais comerciais (GV) e do glúten não vital (GNV) foram similares, especialmente, no teor de proteínas, que foi de 80 % em base seca, e no teor de umidade, que foi inferior a 10 %. Essas são geralmente as informações fornecidas pelos produtores de glúten vital, e que são utilizadas para a classificação do produto como “concentrado proteico” (BRASIL, 2005), porém não refletem a sua qualidade. Usualmente, os testes para determinação do teor de proteína são testes destrutivos, isto é, que não preservam a estrutura da proteína, por isso, estes testes não são capazes de fornecer informações sobre o tipo e a estrutura das proteínas que constituem o GV, dificultando a definição da sua aplicação na panificação.

O fracionamento sequencial de proteínas foi desenvolvido por Osborne (1907) e representa grande importância na avaliação dos tipos e quantidades relativas de proteínas que constituem as frações do GV. Muitos desafios estão presentes nesta técnica, pois a agregação das proteínas, em especial, gliadinas e gluteninas, dificulta a sua separação. Isso pode levar à contaminação das diferentes frações, ou ainda aumentar a insolubilidade dessas proteínas nos solventes, podendo ser erroneamente quantificadas como resíduos. No fracionamento, o fenômeno de agregação das proteínas do GV pode ocorrer pelo uso de diferentes solventes, e também devido à desnaturação mecânica e/ou térmica a que essas proteínas são submetidas durante o processo de obtenção do glúten vital.

Segundo Fu; Sapirstein; Bushuk (1996), a utilização de NaCl na primeira etapa do fracionamento possibilita a agregação entre gliadinas e gluteninas, interferindo na solubilidade dessas proteínas nos demais solventes. Por outro lado, a mistura da farinha e água para obtenção da massa, que leva à desnaturação mecânica do glúten (DOBRASZCZYK, 2004) e a secagem, que leva à desnaturação térmica do glúten (JEANJEAN; DAMIDAUX; FEILLET, 1980; LAGRAIN et al., 2008; MICARD; GUILBERT, 2000; SCHOFIELD et al., 1983; SINGH; MACRITCHIE, 2004; STATHOPOULOS et al., 2008; TATHAM; DRAKE; SHEWRY, 1985; WEEGELS et al., 1994) resultam em modificações estruturais de suas proteínas.

A desnaturação mecânica promove modificações estruturais pela exposição dos resíduos de aminoácidos apolares, que antes estavam localizados em uma região central da molécula de proteína, para a sua superfície, ficando em contato com o ar introduzido com a agitação. Enquanto isso, os aminoácidos polares ficam expostos à fase aquosa, criando uma interface ar-líquido (CAUVAIN, 2015; DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA 2010). À medida que a energia nessas interfaces aumenta, novas orientações moleculares podem levar a alterações estruturais, resultando em agregados proteicos insolúveis.

O tratamento térmico pode levar a uma nova conformação molecular, podendo modificar a quantidade de ligações de hidrogênio e interações eletrostáticas entre as cadeias de proteínas. Por outro lado, as interações hidrofóbicas, que são exotérmicas até aproximadamente 70 °C (DAMODARAN; PARKIN; FENNEMA 2010), podem se estabilizar, levando à formação de agregados proteicos insolúveis, mesmo na presença de agente redutor, a exemplo do β-mercaptoetanol.

Os resultados encontrados para o fracionamento das proteínas mostrou que GVA apresentou quantidades relativas de proteínas nas frações de albuminas/globulinas e de gluteninas semelhantes a GVB, e maior quantidade de proteínas na fração de gliadinas que GVB. Possivelmente, isso ocorreu pela agregação das gliadinas e gluteninas de GVB que dificultou sua separação. A possível alteração da estrutura pelo tratamento térmico das proteínas de GVB foi comprovada pela comparação com glúten não vital (GNV). O GNV apresentou maior quantidade de proteínas na fração de gluteninas que GVA e GVB, refletindo a agregação de gliadinas e gluteninas, pelo efeito da temperatura, resultando na maior quantidade de proteínas na fração de glutenina, por se tratar de agregados solúveis em condições redutoras.

Além disso, os resultados do fracionamento revelaram que GVA apresentou melhor balanço entre gliadinas e gluteninas extraíveis, devido às quantidades relativas de proteínas semelhantes entre suas frações, sendo considerado o principal fator para a qualidade viscoelástica da rede de glúten. Segundo Dahesh et al. (2016); Khatkar; Barak; Mudgil (2013); Khatkar; Bell; Schofield (1995); Lookhart et al. (1993), tanto as gliadinas, quanto as gluteninas, interferem na qualidade viscoelástica da rede de glúten, por isso, quando há um equilíbrio nas quantidades dessas proteínas, a rede de glúten apresenta melhor qualidade, com equilíbrio entre as propriedades de extensibilidade e elasticidade (BEKES; GIANIBELLI;

WRIGLEY, 2004; DELCOUR et al., 2012; WANG; JIN; XU, 2015), refletindo em melhor qualidade dos produtos de panificação, a exemplo dos pães de forma.

Não apenas o fracionamento sequencial foi utilizado para avaliar as frações proteicas existentes no GV, mas também as análises qualitativas de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecil sulfato de sódio (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis – SDS-PAGE) em condições redutoras (pelo uso de β- mercaptoetanol) e não redutoras (sem β-mercaptoetanol) e cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão molecular (size exclusion high-performance liquid chromatography – SEC-HPLC) foram utilizadas para observar a massa molecular aparente das proteínas do GV. Os resultados dessas análises confirmaram a existência de proteínas de diferentes massas moleculares que constituem as frações de albuminas/globulinas, gliadinas e gluteninas de GVA, GVB e GNV; além de agregados proteicos insolúveis, mesmo em condições redutoras e não redutoras na análise de eletroforese, em especial para GVB e GNV. Provavelmente, esses agregados se formaram nessas amostras pela exposição de suas proteínas à alta temperatura.

As interações entre proteínas podem ser avaliadas através da solubilização dos agregados proteicos em solventes específicos (SCHMIELE, 2014). As interações proteicas do glúten envolvem as interações químicas covalentes, principalmente as ligações dissulfeto e em menor grau as ligações cruzadas de tirosina, e as interações químicas não covalentes (interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, interações eletrostáticas, entre outras). Os tipos de interações proteicas que ocorrem nos glútens vitais podem influenciar no mecanismo de formação da rede de glúten, refletindo em diferentes comportamentos viscoelásticos na panificação.

Os resultados da avaliação das interações proteicas deste trabalho mostraram evidências de que as interações hidrofóbicas e as ligações de hidrogênio são fundamentais para a estabilização dos agregados proteicos, tanto para GVA quanto para GVB. As ligações SS, embora em pequenas quantidades, também têm papel importante na formação dos agregados, principalmente, por participarem do mecanismo de intercâmbio entre SH/SS. Já, o GNV, apresentou baixa solubilidade em todos os sistemas utilizados para avaliação das interações químicas, provavelmente porque o tratamento térmico provocou alterações estruturais que impossibilitaram a solubilização de seus agregados nos solventes utilizados.

As interações SS, geralmente, ocorrem em menor quantidade que as interações não covalentes, mesmo assim são relevantes na estabilização de agregados e na formação da rede (HUEQNER et al., 1977; WALL, 1971), e isso foi observado para GVA e GVB. A pequena quantidade de SH livre encontrada nos GV e no GNV foi também confirmada pela técnica de espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy – FTIR). Pelo FTIR, foi possível verificar a presença das estruturas secundárias das proteínas presentes nos GV e no GNV, e confirmou-se a pequena quantidade de grupos SH livres, pela presença da banda de cistina em detrimento da banda de SH livre (banda em 2560 cm-1), indicando que a cisteína foi oxidada à cistina por meio de ligações SS. As estruturas secundárias encontradas foram α-hélice (1648-1657 cm-1), β-folha (1623-1641 cm-1 e 1674-1695 cm-1), β-volta (1662-1686 cm-1), e estruturas desordenadas (1642-1657 cm- 1

) (TATTINI JR; PARRA; PITOMBO, 2006; WANG; GUO; ZHU, 2016).

Muito embora tenham sido observadas pequenas diferenças químicas entre GVA e GVB, a microscopia eletrônica de varredura revelou que ambos os GV formaram rede de glúten uniforme e contínua com estruturas semelhantes, podendo ser utilizados na panificação. Porém, os tipos de interações moleculares que ocorrem entre as gliadinas e gluteninas de GVA ou GVB podem levar a diferenças nas propriedades viscoelásticas de suas redes quando hidratados e submetidos ao trabalho mecânico. Desta forma, os testes reológicos fundamentais e empíricos podem ser boas ferramentas para melhor entender as diferenças entre os glútens vitais comerciais.