CHAPITRE II : L’INFLAMATION
III. 1.1.1.1.Extraction solide-liquide
III.2. Animaux et conditions délavage
III.2.1 Traitement des rats
Les 20 rats femelles après la période d'adaptation ont été répartis en 4 lots de 5 et ont traités avec les doses suivantes :
Groupe I :"Des Témoins " les rats ne reçoivent aucun traitement.
Groupe II :Par gavage les rats ont été traités à la dose de 250 mg/kg (PC) d’extrait méthanolique de la plante Laurus nobilis L (Gazwi et al., 2020)
Groupe III :Les rats ont été traités à la dose de 2ml/kg poids corporel (PC) d’acide acétique (AA) 5% par voie intra rectale(Kolgazi et al., 2013 ; Elsayed Ashry et al., 2016) .
Groupe IV : Les rats traités avec250 mg /kg d’extrait de Laurus nobilis L (Gazwi et al., 2020) par gavage et après 30 min du temps elles sont reçoit par voie intra rectale 2ml /kg d’acide acétique 5% (Kolgazi et al., 2013 ; Elsayed Ashry et al., 2016) .
Ce traitement a été poursuivi pendant Cinque jour.
La prise du poids corporel des rats femelles est effectuée à l’aide d’une balance Kern EMB 500- 1 (Résolution : 0,01 g) chaque deux jours pendant la semaine qui précède le traitement, puis chaque jour durant la période du traitement.
III.3. Sacrifice et prélèvements des organes
III.3.1. Prélèvement sanguin A la fin de la période de traitement les animaux préalablement anesthésiés par du chloroforme pendant 2 à 3 min, le sang est prélevé par ponction de l'aorte abdominale à l’aide d’une seringue de 5ml et immédiatement recueilli dans des tubes étiqueté pour chaque rat.
Des tubes EDTA pour la détermination de (NFS) numération de formule sanguin
Des tubes héparine, pour le dosage de la CRP.
Les tubes ont immédiatement transportés dans une glacière au laboratoire d’analyse (L'laboratoire d'Analyse Médicale NOVOLABE - El khroube ; Constantine )
PARTIE PRATIQUE MATERIEL ET METHODES
III.3.2 Prélèvement des organes
Les organes (reins, foie, côlon) sont soigneusement prélevés et rincés avec une solution physiologique (NaCl 0 ,9%) et débarrassée de leur tissu adipeux, puis pèse pour déterminer le poids relatif.
Un fragment du colon est fixé dans le formol 10% afin de réaliser des coupes histologiques
5 Rats Témoins
Le jour de sacrifice
Prélèvement sanguin. Prélèvement des organes.
5 Rats traités Par AA 2ml/kg 5 Rats traités
Par dose de 250mg /kg du
LN
5 Rats traités Par 250mg/kg du LN + dose
de 2ml AA
Après Cinque jours de traitement
NFS
CRP Poids relatif.
Etude macroscopique / microscopique du colon.
Coupes histologiques du colon.
Adaptation 15 jours
PARTIE PRATIQUE MATERIEL ET METHODES
39
L’activité Anti Inflammatoire De Laurus Nobilis L Sur La Colite Induite Par L’acide Acétique Chez Les Rats De La Souche Wistar
III.4. Méthode de dosage des différents paramètres biologiques III.4.1. La numération formule sanguine (NFS)
La numération formule sanguine (NFS) ou "hémogramme" est un examen biologique permettant de déterminer la nature des cellules présentes dans le sang . Ce dernier a été réalisé sur un analyseur automatisé "Mindray BC -6200 ",il effectue une analyse de façon électronique quantitative et qualitative des éléments figurés du sang : globules blancs (GB) ,Lymphocytes (LYM),Neutrophiles (NE) ,Granulocytes (GRA), Monocytes (MO) , Eosinophiles (EO) ,Basophiles (BA) , Plaquettes (PLA) , Globules rouges (GR) , Taux d’hématocrites (HT) ,Taux d’hémoglobines (HB) ,Volume globulaire moyen (VGM ) ,Teneur globulaire moyenne en hémoglobine (TGMH) , Concentration corpusculaire moyenne hémoglobine (CCMH ) .
III.4..2. La protéine C-réactive (PCR)
La protéine C-réactive (PCR) est la protéine la plus sensible de phase aiguë classique dans les réactions inflammatoires. Cette technique a été réalisée sur un analyseur automatisé Cobas C 501
III.4.2.1. Dosage de protéine C-réactive (CRP)
Roche Cobas C 501 est un système de diagnostic in vitro conçu pour la détermination quantitative photométrique de la protéine C‐réactive (CRP) dans des échantillons humains de sang total et sérum capillaires, et de sang total et plasma recueillis sur les anticoagulants héparine de lithium ou EDTA K2/K3.
La détermination de la CRP sert à évaluer les processus
Inflammatoires et les maladies, infections et lésions cellulaires associées.
Les érythrocytes du sang total capillaire et veineux sont séparés du plasma par centrifugation. Le plasma est ensuite dilué avec un tampon HEPES et
transféré dans la chambre de réaction où il est mélangé avec le réactif d'anticorps anti‐CRP sur latex. La CRP contenue dans le plasma dilué se lie
à l'anticorps anti‐CRP sur la particule de latex. La concentration en CRP est
PARTIE PRATIQUE MATERIEL ET METHODES
calculée en fonction de la variation d'absorbance mesurée à 525 nm et 625 nm qui est en relation avec le degré d'agglutination.
III.5. Etude histologique
Des sections des colons (partie distal) ont été nettoyée et coupée longitudinalement et conservée dans des petits flacons contenant une solution de formol (10%).
Les coupes histologiques ont été réalisées au niveau du service d’Anatomie Pathologique : Centre Hospitalo-Universitaire (CHU BEN BADIS -Constantine). La technique utilisée est celle décrite par (Hould, 1984) qui comporte les étapes suivantes :
Fixation : La fixation des échantillons a été faite dans le formol (10%).
Les prélèvements réalisés sont alors mis dans des cassettes spéciales à parois tournées afin de permettre le passage des liquides.
Déshydratation des échantillons
Au début, il faut déshydrater les échantillons à l’aide d’un automate qui permet le passage automatiques et progressif des échantillons dans des bains d’éthanol de concentration croissante (70%, 95% et 100%).
L’inclusion et réalisation des blocs
Les pièces sont alors plongées dans des bains de paraffine liquide.
Les tissus étant maintenu et imbibés de paraffine, viennent alors l’étape de
l’enrobage qui consiste à inclure le tissu imprégné dans un bloc de paraffine qui, en se solidifiant, va permettre sa coupe. Cette opération fait appel à des appareils « dits à inclusion » refermant un réservoir de paraffine maintenue à l’état liquide par un système de chauffage, un petit robinet et une plaque métallique réfrigérée pour obtenir la solidification rapide du bloc de paraffine contenant le tissu.
La réalisation des coupes minces de quelques microns (1-5 µm en moyenne) est possible grâce à des appareils spéciaux appelés « Microtomes ». Ces coupes sont étalées sur des lames porte-objet, déplissées et fixés sur la lame par l’utilisation d’une eau gélatineuse chauffée.
PARTIE PRATIQUE MATERIEL ET METHODES
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L’activité Anti Inflammatoire De Laurus Nobilis L Sur La Colite Induite Par L’acide Acétique Chez Les Rats De La Souche Wistar
coloration
Pour la coloration, on a utilisé la technique à l’Hématoxyline-Eosine où
(Hématéine-Eosine) ; qui nécessite la présence de l’alcool acide (100 ml d’alcool éthylique à 70° + 50 ml d’acide HCl), eau ammoniacale (100 ml d’eau distillée + 2 ml Ammoniaque) et solution d’Eosine (100 ml Eosine solution aqueuse à 3%, 125 ml alcool éthylique à 95°, 375 ml d’eau distillée et 2 gouttes d’acide acétique). La coloration suive les étapes suivantes :
Déparaffiner et hydrater les lames à l’eau du robinet puis rincer à l’eau distillée ;
Immerger dans un bain d’Hématoxyline de Harris (15 minutes) qui colore en bleu violacée les structures basophiles (noyaux) ;
Différencier les coupes dans l’alcool acide (1 à 2 plongées) ; déposer ensuite les lames dans un bain d’eau du robinet et vérifier la différenciation au microscope
Bleuir dans un bain d’eau ammoniacale ;
Immerger dans un bain d’Eosine (15 secondes à 2 minutes) qui colore en rose les structures acidophiles (cytoplasme). Tous ces bains sont séparés par des lavages à l’eau du robinet ;
Les préparations ont ensuite été séchées puis observées au microscope optique et photographiées à l’aide d’un appareil photo.
III.6.Analyses statistiques Les résultats ont été exprimés en moyenne plus au moins l'écart types [Moy ± ET].
Les différences entre les moyennes des groupes ont été déterminées par analyse de variance (ANOVA).
L'analyse statistique est réalisée par le teste de Student pour la comparaison des
moyenne deux à deux, à l'aide du logiciel Excel 2010 . Les différences sont considérées comme :
PARTIE PRATIQUE MATERIEL ET METHODES
Significatif lorsque (* P <0,05)
Hautement significatif comptant au témoin (** P< 0,01)
Très hautement significatif comptant au témoin (*** P<0,001) Avec P : seuil de signification.
PARTIE PRATIQUE RESULTATS
IV. Résultats
IV.1. Etude pondérale
IV.1.1. La croissance corporelle
Lors du suivi du poids corporel des rats femelles ayant subi les différents traitements, nous observons une diminution du poids chez les rats traités par l’acide acétique (perte du poids corporel plus au moins élevé -18.9 g) par rapport aux rats témoins, mais cette diminution n’est pas statistiquement significative.
Tandis que, les rats traités par laurus nobilis L (LN) présentent une augmentation du poids (+25.53 g) par rapport aux rats témoins. (Voir tableau 7et figure14).
Nos résultats montrent aussi une légère diminution du gain de poids corporel chez le lot traité par la combinaison (LN+AA) avec une perte du poids de (- 4.9g) par rapport aux rats témoins.
IV.1.2. Action sur le poids relatif (PR) de certains organes
Les résultats obtenus montrent que y’a une augmentation significative
(P ≤ 0,05) de poids relatif du foie chez le groupe traité par l’AA par rapport au groupe témoin,
Par contre on ne trouve aucune variation significative de poids relatif du rien chez tous les groupes traités que ce soit par l’acide acétique ou bien les groupes témoins (Voir tableau 7et figure 15).
Tableau 07. Variation du poids corporel PC (g) et du poids relatif PR (g/100 g de poids corporel) des organes (foie, rein) chez les rats témoins et traitées par l’acide
acétique, Laurus nobilis L (LN). et à la combinaison (LN+AA).
Paramètre Témoins LN AA LN+ AA
Poids initiale 221.2 ±43.30 231.29 ±45.89 231.4 ±47.34 227.9 ±64.12 Poids finale 247.82±40.99 256.82 ±27.25 212.5 ±46.83 223 ±39.16
Gainde poids 26.62 25.53 -18.9 -4.9
PR de foie 3,5464 ±0.13 3,774 ±0.32 4,1147 ±0.47 * 3,8186 ±0.31
PARTIE PRATIQUE RESULTATS
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L’activité Anti Inflammatoire De Laurus Nobilis L Sur La Colite Induite Par L’acide Acétique Chez Les Rats De La Souche Wistar
PR de rein 0,6036 ±0.01 0,568 ±0.07 0,59175 ±0.07 0,5996 ±0.06
Figure 14 . Variation de poids corporel en (g) des rattes témoins et les traitées ; par L’acide acétique, laurus nobilis L. et la combinaison (LN+AA) après 5
jours de traitement.
Figure 15 . Variation du poids relatif de certains organes (Foie, rein) chez les rats témoins et les traitées après 5 jours de traitement.
0
PARTIE PRATIQUE RESULTATS
IV.2. Etude de quelques paramètres hématologiques
IV.2.1. Globules blancs, monocytes, éosinophiles, lymphocytes et
Neutrophiles Les résultats obtenus montrent que le traitement par l’acide acétique (AA)
provoqué une augmentation significative (P ≤ 0,05) des éosinophiles et globule blanc.
Alors que, on observe une augmentation des lymphocytes, neutrophiles mais qui n’est pas enregistrer une variation significative en comparaison avec le lot témoins.
D’après l’étude statistique on trouve une augmentation hautement significative (P ≤ 0,01) des monocytes chez les rats traités par l’acide acétique par rapport au lot témoins. (Voir tableau 8 et figure 16). Par ailleurs, aucune différence significative n’est enregistrée chez les rats traités par la LN par rapport aux rats témoins.
IV.2.2.Globules rouges,HB ,hématocrite,VGM, TCMH et CCMH, plaquettes L’étude statistique de nos résultats montre une diminution significative avec un seuil de signification (p≤0.05) du nombre de globules rouges et des taux de l’hématocrite chez les rats traités par l’AA en comparant au lot témoin.
On note aussi une légère diminution de taux d’hémoglobine, de volume globulaire moyen et de la concentration corpusculaire moyenne en
hémoglobine chez les rats traitées par l’acide acétique en comparant au lot
témoin, mais statistiquement reste non significative (Voir tableau 8 figure 17).
Par contre, une augmentation significative (p≤0.05) en l’hémoglobine et en l’hématocrite est enregistrée chez les rats traités par la combinaison (LN+AA)
par rapport aux rats traités par l’acide acétique. (Voir tableau 8 figure 17).
PARTIE PRATIQUE RESULTATS
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L’activité Anti Inflammatoire De Laurus Nobilis L Sur La Colite Induite Par L’acide Acétique Chez Les Rats De La Souche Wistar
Tableau 8. Variation de quelques paramètres hématologiques chez les rats témoins et les traitées par l’acide acétique, plante Laurus nobilis L et la
combinaison (LN+AA). Plaquettes(×103 /ml) 817.2±106.84 829.2±110.85 833.6 ±133.70 849 ±49.48
Différence significative en comparant au groupe témoin :
*P ≤ 0,05 ; ** P ≤ 0,01 ; *** P ≤ 0,001.
Différence significative en comparant au groupe traité par l’acide acétique :
# P ≤ 0,05 ; ## P ≤ 0,01 ; ### P ≤ 0,001.
PARTIE PRATIQUE RESULTATS
P : seuil de signification.
Figure 16 . Variation des globules blancs (×103/μl), des lymphocytes (×103/μl), MEB (×103/μl), des éosinophiles (×103/μl), monocytes (×103/μl) et
PARTIE PRATIQUE RESULTATS
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L’activité Anti Inflammatoire De Laurus Nobilis L Sur La Colite Induite Par L’acide Acétique Chez Les Rats De La Souche Wistar
neutrophiles (×103/μl) chez les rats témoins et traitées, après 5 jours de traitement.
Figure 17 .Variation des, globules rouge (×103/μl), Taux d’hémoglobine (g/dl), VGM (fl),CCMH (g/dl) et hématocrites (%) chez les rats témoins et
traitées, après 5 jours de traitement.
PARTIE PRATIQUE RESULTATS
IV.3. Etude de paramètre biochimique IV.3.1. La protéine C réactif
Les résultats obtenus montrent qu’il y’a une augmentation significative (P≤0,05) de la CRP chez les rats traité pas l’acide acétique par apport aux rats témoins.
Aucune différence significative des valeurs de la CRP n’est enregistrée chez les rats traités par la LN comparant au lot témoins.
Par ailleurs, on observe une diminution significative (P≤0,05) des taux de CRP chez les rats traités par la combinaison (LN+ AA) comparativement au lot des rats traités par l’AA (voir tab 09et figure 18).
Tableau09. Variation de protéine C réactive chez les rates témoins et traités, par acide acétique, LN et la combinaison (LN + AA).
Paramètre T LN AA LN+AA
CRP (mg/l) 0.092±0.01 0.1±0.01 0.164±0.03 * 0.11±0.01 # Différence significative en comparant au groupe témoin :
*P ≤ 0,05 ; ** P ≤ 0,01 ; *** P ≤ 0,001.
Différence significative en comparant au groupe traité par l’acide acétique :
# P ≤ 0,05 ; ## P ≤ 0,01 ; ### P ≤ 0,001.
PARTIE PRATIQUE RESULTATS
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L’activité Anti Inflammatoire De Laurus Nobilis L Sur La Colite Induite Par L’acide Acétique Chez Les Rats De La Souche Wistar
Figure 18. Variation de la CRP (mg /L) chez les rats témoins et les traitées ; après 5 jours de traitement.
IV.4. Etude macroscopique du colon des rats témoins et traitées
Les spécimens coliques des rats ont montré que l'administration intra-rectale de l'acide acétique a provoqué des dégâts macroscopiques et des dommages intenses au niveau du gros intestin qui sont traduits par : des blessures épithéliales, inflammation de la muqueuse locale, gonflement et
épaississement de la paroi, sans changement de la coloration.
Par ailleurs, aucune altération n'a été détectée après les observations macroscopiques des côlons des rats témoins et les rats traitées par Laurus nobilis L (LN) et par la combinaison (LN+AA).
IV.5. L’étude histologique
La photomicrographie des côlons des rats traités par 2 ml/kg PC d’acide acétique 5% (v/v) par voie intra-rectale pendant 5 jours expose des changements histopathologiques graves tels que: la dégénérescence de l’épithélium associée avec l’infiltration de cellules inflammatoires dans la
muqueuse et sous-muqueuse, la déplétion des cryptes Par ailleurs, les observations microscopiques du côlon des rats témoins et
Traités par LN seul ou à la combinaison (LN+AA) ont montré une couche de
0
PARTIE PRATIQUE RESULTATS
mucus et des cryptes normales et aucune infiltration leucocytaire. (voir la figure 19).
Figure 19. Les coupes histologiques de côlon distal d’un rat témoin (T) et traités par l'extrait méthanoloque de Laurus nobilis L (LN), l’acide acétique (AA) et par la
combinaison (LN/AA) colorées à Hématéine-Eosine 100X.
Destruction des cryptes ; Infiltration de cellules inflammatoires ; épithélium de surface dégénéré .
AA AA
AA LN+AA
T LN
DISCUSSION
Notre étude est réalisée avec une dose de 250 mg/Kg PC de l’extrait méthanolique de la plante laurus nobilis L. et la dose de 2 ml/kg PC d’acide acétique à 5% en se référant aux travaux effectués par (Gazwi et al., 2020) et (Kolgazi et al., 2013 ; Elsayed Ashry et al., 2016) respectivement.
Un des modèles généralement utilisés pour étudier l’inflammation colique est la colite induite par l'acide acétique chez le rat (Macpherson et Pfeiffer, 1976 ; 1978).
Cette colite expérimentale est semblable à celle induite chez l’être humain dans certains aspects ; l’inflammation aiguë avec infiltration de neutrophile et une grande formation de métabolites d'acide arachidonique (Krawisz et al., 1984 ;
Pfeiffer, 1985 ;Sharon et Stenson, 1985).
La détection de l'inflammation, les lésions intestinales et la quantification de leur sévérité sont appréciés à l'aide de différents critères ; Les plus classiques sont ; la mortalité, la perte de poids corporel de l'animal, l’aspect macroscopique, l’intensité de l'infiltration et l'élévation de marqueurs biochimiques (TNFα, Interleukine 1) dans l'intestin permet d'apprécier globalement l'intensité de la réaction inflammatoire (Nancey et al., 2008).
Premièrement, d’après les résultats obtenus dans notre expérimentation, l’administration de 2ml/kg d’acide acétiquecomme un agent pro-inflammation par voie intra-rectale chez les rats femelles de la souche Wistar a provoquée :
Une diminution de la croissance corporelle par rapport à celle des témoins. Le changement du poids corporel est utilisé comme un indicateur des effets indésirables des composés chimiques (Hilaly et al., 2004). La perte du poids est corrélée à l’état physiologique de l’animal et peut être expliquée aussi par la réduction de la consommation des aliments.
Une augmentation du poids relatif du foie a été observée chez les rats recevant l’acide acétique. La variation du poids des organes internes est un bon indice pour l’évaluation de la toxicité d’une substance (Teo et al. 2002). Le foie, les
DISCUSSION
53
L’activité Anti Inflammatoire De Laurus Nobilis L Sur La Colite Induite Par L’acide Acétique Chez Les Rats De La Souche Wistar
reins sont les premiers organes affectés par la réaction métabolique provoquée par ce produit chimique (Jothy et al.2011).
Une autre étude, montre que l’augmentation du poids relatif d’un organe peut être liée à une congestion par réservation du sang dans le tissu, l’hypertrophie tissulaire (Rasekh et al., 2008) ou par la présence d’un infiltrat inflammatoire (Betti et al.,2012).
L’analyse des populations cellulaires circulantes montre :
Une diminution des GR, HGB, HCT, et de VGM chez les rats traités par l’acide acétique e par rapport aux témoins. Cette diminution témoigne l’installation d’une anémie, cette anémie est due à la surproduction de radicaux libres par l’acide acétique, ces RLs vont s’attaquer aux membranes des GR conduisant à leur lyse et par conséquent à une diminution de leur nombre avec une
modification des HGB, HCT et VGM.
Une augmentation importante des GB, lymphocytes, neutrophiles, monocytes, et éosinophiles par rapport aux témoins.
En effet, les rats exposés à l’acide acétique mobilisent toute ces capacités de défense pour lutter contre la présence de cet agent pathogène dans son organisme (Karmakar et al., 2000). Ce qui explique d’ailleurs l’augmentation de l’ensemble des cellules immunitaire dans notre expérimentation, ce qui confirme aussi l’implication directe de ces cellules dans la défense
immunitaire contre les agents pathogènes.
En revanche, on a observé chez les rats traités par la combinaison (LN+AA) une amélioration de certains paramètres (retour à la normale d’HGb et
Hématocrite), cela est dû à la richesse de cette plante en molécules
antioxydantes comme les polyphénols et les flavonoïdes, qui ont un pouvoir protecteur contre les effets délétères des RLs.
L’analyse statistique de la CRP a permis de constater une augmentation de ces valeurs chez les rats traités par l’AA, témoignant de la présence d’une inflammation.
DISCUSSION
En effet la CRP est un paramètre précoce mais non spécifique de l’inflammation sa concentration s'élève dès la 6ème heure de l'inflammation. En moyenne, elle devient pathologique 24 heures après le début de l'inflammation et se normalise rapidement après la disparition de la source de l’inflammation (Borghini et al., 2013). Elle est donc un marqueur biologique stable pour détecter une
inflammation à un stade précoce.
L’étude macroscopique du côlon a révélé que l'administration intra-rectale de l'acide acétique à 5% provoque une acidification intracellulaire massive
entraînant des dommages intenses dans le gros intestin (Souza et al., 2016). Ces dommages sont traduits par le changement de l'épaisseur du côlon en raison des érosions, des blessures épithéliales et de l’inflammation de la muqueuse locale et la sous muqueuse (Minaiyan et al., 2006 ; Mustafa et al., 2006 ; Tsianos et al., 2009),
Les changements observés résultent de l'activation des cellules immunitaires résidentes et l’infiltration des cellules inflammatoires circulantes (Podolsky, 2007
; Abraham et Cho, 2009).
En effet, la réponse inflammatoire a été classée en fonction de l'étendue de la destruction de la muqueuse normale : l’architecture, la présence et le degré de l’infiltration cellulaire, l’épaississement et la présence ou l’absence des cryptes.
L’observation microscopique des intestins (côlon) des rats traités par l’acide acétique a montré de profonds changements histopathologiques : une rupture de l’épithélium intestinal avec ablation des cryptes, la présence d’ulcération, une destruction de l'architecture épithéliale, et une infiltration de cellules inflammatoires dans la muqueuse, ce qui concorde les travaux réalisés par (Simkin et al., 2000 ; Kolgazi et al., 2013 ; Ashry et al.,2016).
DISCUSSION
55
L’activité Anti Inflammatoire De Laurus Nobilis L Sur La Colite Induite Par L’acide Acétique Chez Les Rats De La Souche Wistar
Dans un second temps, d’après les résultats obtenus dans notre expérimentation, on peut dire aussi que le Co-traitement par l’extrait méthanolique de Laurus nobilis avec l’acide acétique a fourni une protection significative aux paramètres étudies (poids corporel, les poids relatifs de certains organes cibles, quelques paramètres hématologiques, CRP et même au niveau des coupes histologiques) qui ont été altérés en présence d’acide acétique seul.
Cette protection est expliquée par la richesse de cette plante en composés bénéfiques comme les polyphénols (Acide phénylacrylique, carbonique : libres ou estérifiés, acides p-coumarique, fénulique, sinapique, gentisuque et
vanillique) (Barla et al., 2007), et les flavonoïdes principalement (la rutine, l’isoquercitrine, l’hypéroside et kaempférol-3 rhamnoside et3- arabinoside. Le kaempférrol-3-rhamnoside, 2-p-coumaroyles) (Fiorini et al., 1998 ; Kang et al.,
vanillique) (Barla et al., 2007), et les flavonoïdes principalement (la rutine, l’isoquercitrine, l’hypéroside et kaempférol-3 rhamnoside et3- arabinoside. Le kaempférrol-3-rhamnoside, 2-p-coumaroyles) (Fiorini et al., 1998 ; Kang et al.,