Les arguments en faveur du fichier positif

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Discussão

Essa tese de doutorado teve seu início em 2011 em um contexto onde o laboratório ThoMSon de espectrometria de massas havia adquirido recentemente um espectrômetro de massas TOF/TOF modelo Autoflex III (Bruker). Nesse início havia a necessidade de explorar novas aplicações que vinham sendo reportadas em trabalhos de diversos pesquisadores pelo mundo e que ainda eram pouco ou inexploradas no Brasil. Em outras palavras, buscávamos dar início no laboratório em novas linhas de pesquisa.

Os trabalhos publicados escolhidos para compor essa tese de doutorado resumem o trabalho desenvolvido nos últimos anos, muitos dos quais não geraram publicações ou resultados satisfatórios, porém serviram de base para o aprendizado que resultou nos trabalhos apresentados nessa tese e outros também publicados ou em vias de publicação. Nesse sentido, buscamos explorar as aplicações do equipamento utilizando duas abordagens diferentes: a análise por espectrometria de massas por fingerprinting e a espectrometria de massas por imageamento químico.

O primeiro trabalho, apresentado no item 2.1 cujo título pode ser traduzido para o português como “Fulerenos em asfaltenos e outros materiais carbonáceos: constituintes naturais ou artefatos do laser?” Teve como objetivo inicial utilizar a técnica de MALDI ou LDI-MS para a análise de asfaltenos. Esse trabalho surgiu em um contexto onde o laboratório ThoMSon dava início a um novo projeto em parceria com a Petrobras e que buscava uma abordagem de análise tridimensional do petróleo. Utilizando o conhecimento já estabelecido e fundamentado na análise dos compostos polares do petróleo por FT-ICR MS, começamos a explorar a análise de outras frações empregando outras abordagens tais como a análise dos compostos polares por mobilidade iônica e a análise de das frações SARA (saturados, aromáticos, resinas e asfaltenos) empregando outras fontes de ionização, como por exemplo, MALDI.

Os asfaltenos são, por definição, componentes do petróleo insolúveis em alcanos de baixa massa molecular tais como n-pentano e n-hexano. Assim, a primeira etapa desse trabalho consistiu em reunir diferentes amostras de petróleo com diferentes níveis de evolução térmica. Cerca de trinta amostras foram separadas e a fração de asfaltenos foi separada de cada amostra por precipitação.

Conforme mencionado anteriormente a abordagem de análise que pretendíamos utilizar com essas amostras era a análise por fingerprinting e assim, por quimiometria identificar possíveis marcadores de evolução térmica utilizando essas amostras iniciais para elaborar o modelo de estudo.

Em um primeiro momento escolheu-se aleatoriamente algumas amostras para otimizar as condições da fonte, maximizando a ionização. Uma vez que haviam diversos trabalhos publicados utilizando a análise por LDI e MALDI-MS a primeira etapa consistiu em testar qual das duas técnicas funcionaria melhor. Apesar das estruturas químicas dos asfaltenos não serem bem descritas, tínhamos uma ideia, com base na literatura que, assim como na fração polar ou no caso dos compostos aromáticos de baixa massa molecular, que o perfil obtido seria algo muito próximo a uma distribuição Gaussiana devido a presença de séries homologas de compostos com estruturas semelhantes que diferenciavam entre si pelo aumento no número de carbonos em suas estruturas.

O problema de se utilizar MALDI nesse caso estava na limitação da detecção de compostos na faixa de m/z abaixo de 600 Da. Essa limitação se deve a elevada interferência causada pela ionização da matriz que por estar em maior proporção que a amostra causa supressão dos componentes de interesse da amostra.

Os testes iniciais mostraram que não havia diferença alguma no perfil obtido para as amostras testadas tanto utilizando matriz (foram testadas dois tipos de matriz diferentes, a DHB e a 7,7,8,8-tetracyanoquinomethane) quanto na análise por LDI-MS obtendo-se sempre os mesmos resultados na faixa de m/z acima de 600 Da. Já era de certo modo esperado que mesmo na ausência de matriz fosse possível a análise dos compostos presentes nas amostras de asfaltenos. Isso porque acredita-se que estes sejam formados por estruturas poliaromáticas que absorveriam a energia do laser sendo assim fotoionizados.

A vantagem de se utilizar a técnica de LDI-MS, consistia também no fato de que na mesma análise poderíamos abranger uma maior faixa de massa sem ter que trabalhar com a possiblidade de formação de cluster dos asfaltenos com a matriz dificultando assim interpretações e atribuições errôneas do espectro.

Vale nesse ponto ressaltar que, devido a elevada complexidade da amostra e o fato do analisador de massas por tempo de voo não ter resolução suficiente para atribuição de formulas moleculares inequívocas (tal como o analisador FT-ICR MS), não era o nosso objetivo caracterizar a amostra nesse nível de detalhamento mas avaliar pequenas diferenças que fossem capazes de diferenciar as amostras e assim caracterizá-las de forma simples e rápida.

A grande vantagem da análise por LDI e MALDI-MS consiste na rapidez de análise e a possibilidade de se analisar concentrações muito baixas de amostras. Isso torna a análise mais simples e rápida sendo portanto o cenário ideal para a análise de petróleo devido a elevada demanda de amostras, que consomem um grande tempo de equipamento (no caso das análises

por ESI-MS) somando-se o tempo de análise ao tempo gasto com limpeza da fonte após cada amostra, a economia de tempo de equipamento e do analista superaria consideravelmente a análise por FT-MS que poderia ser empregada apenas em casos onde um maior detalhamento de caracterização da amostra fosse necessário.

Outro fato que nos impulsionou a avaliar esse tipo de análise reside no fato de não ser observado na análise convencional por ESI-MS uma ionização satisfatória dos asfaltenos. Deste modo caso fosse possível avaliar de fato os componentes presentes na fração asfaltenica de cada uma das amostras esse perfil poderia ser comparado com as informações obtidas nas análises dos componentes polares presentes em cada amostra analisados por ESI-FT-ICR MS.

Infelizmente, conforme reportado no artigo publicado na revista Analyst não havia diferenças consideráveis entre os perfis obtidos para as trinta amostras analisadas. A única diferença observada entre as amostras, obtida por PCA (principal componente analysis) residia na faixa de massa abaixo dos 500 Da. Em outras palavras, o que promovia a diferença não eram os compostos que atribuíamos aos asfaltenos, mas a análise da fração maltênica residual do processo de extração dos asfaltenos (chama-se “maltenos” os compostos solúveis em n- alcanos).

A análise quimiométrica nos deu um primeiro indício de que algo não estava correto, visto que esperávamos ao menos uma leve diferenciação entre amostras com características tão diferentes. Porém ainda trabalhávamos com a hipótese dos compostos presentes na fração de asfaltenos não serem afetados pelo processo de evolução térmica do petróleo. Porém, dando continuidade as análises tentamos caracterizar os compostos obtidos por meio de experimentos MS/MS e constatamos que independente do composto a fragmentação sempre era gerada por perdas sucessivas de m/z 24 caracterizando assim compostos fulerenicos.

Nesse momento demos início a um longo período de pesquisas bibliográficas até entendermos que de fato, o perfil observado para as amostras de asfaltenos eram na verdade artefatos formados na fonte de ionização. Porém, mais impressionante que isso foi constatar a quantidade de trabalhos publicados que, mesmo obtendo esses mesmos artefatos formados na fonte de ionização, consideravam esse perfil, devido ao total desconhecimento da amostra analisada, como real e característico de amostras de asfaltenos, chegando a propor estruturas para explicar a diferença de 24 Da entre os sinais observados no espectro.

Apesar de não termos conseguido obter sucesso no nosso objetivo inicial de análise de amostras de asfaltenos o trabalho foi de extrema importância para relatar essa formação de artefatos e alertar a comunidade científica que resultados errôneos estavam sendo publicados

com frequência. Em contrapartida, observamos que a formação desses artefatos parece ser inerente de alguns equipamentos devido a características específicas do laser. Existem trabalhos onde esses artefatos não parecem ser formados, porém, é algo que precisaria ser testado comparando-se as mesmas amostras. Isso porque o perfil de fulerenos parece ser formado em amostras com elevada concentração de compostos aromáticos policíclicos e sabe-se que a composição pode se alterar dependendo do método de obtenção das amostras de asfaltenos.

Ainda na abordagem de análise por fingerprinting, o perfil lipídico de embrião único era uma área de grande interesse em nosso laboratório. O primeiro trabalho de nosso grupo de pesquisa na análise por MALDI de embrião único foi desenvolvido em parceria com outro grupo de pesquisa76. Assim o trabalho apresentado no item 2.2 cujo título pode ser traduzido para o português como “variação do perfil de fosfatidilcolina e esfingomielina em blastocistos de Bos taurus indicus e Bos taurus taurus produzidos in vivo e in vitro” foi o primeiro trabalho desenvolvido no equipamento Autoflex III (Bruker) e cujas análises de MALDI foram realizadas em sua totalidade no laboratório ThoMSon.

Esse trabalho foi realizado em parceria com a faculdade de medicina veterinária da Unesp de Botucatu que nos trouxe a problemática inicial. Todas as etapas de obtenção e maturação dos oocitos, fertilização e cultura in vitro dos embriões, ou ainda a produção e coleta dos embriões produzidos in vivo foram inteiramente realizadas pelos pesquisadores da Unesp sem a participação do nosso grupo. De forma semelhante, a análise semiquantitativa utilizando o corante Sudan black e parte da análise estatística envolvendo ANOVA, embora discutida entre os dois grupos foi realizada pelos pesquisadores da Unesp.

Nosso papel nesse trabalho esteve focado na obtenção do perfil lipídico característico de cada embrião bovino analisado e na interpretação dos resultados obtidos utilizando para isso uma análise quimiométrica por componentes principais (PCA).

As etapas iniciais que estabeleciam condições de armazenamento, transporte e lavagem dos embriões antes da análise haviam sido estabelecidas no trabalho inicial76 e foram seguidas desde os primeiros testes realizados. Da mesma forma, a escolha da matriz (DHB) e sua concentração foram estabelecidas anteriormente e seguidas nesse trabalho.

Embora houvesse uma experiência anterior do nosso grupo de pesquisa nesse tipo de análise a transferência da metodologia para o novo equipamento não foi uma tarefa simples. Foi necessário a otimização da metodologia e isso que exigia, entre outras coisas, o entendimento do posicionamento correto do embrião na placa. Essa era uma etapa fundamental

visto que, devido a quantidade reduzida de material, era necessário direcionar o laser na posição correta onde estaria o embrião dentro do spot da placa de MALDI.

Residia no posicionamento do embrião na placa nossa primeira dificuldade no trabalho, visto que o embrião bovino com 7 dias se encontra na fase de blastocisto e mede aproximadamente 200 µm. Essa dificuldade foi superada utilizando o mapeamento da posição de cada embrião em seu respectivo spot na placa de MALDI utilizando uma lupa. Adicionalmente foram realizados diversos testes para entender o posicionamento final da placa dentro do equipamento e relacioná-lo com o “mapa” dos embriões. Resolvido esse problema e otimizado o método de obtenção do espectro, o novo desafio estava no tratamento dos dados para análise quimiométrica.

A matriz DHB apresenta uma desvantagem por formar, de modo não homogêneo, cristais em formato de agulha. Essa característica faz com que determinadas regiões na amostra possuam uma maior concentração de matriz (chamadas de hot spot) levando a uma ionização desigual que, se não tratada de forma correta pode acarretar em diferenças significativas em espectros de amostras que seriam consideradas equivalentemente semelhantes. Isso pode atrapalhar e muito a análise quimiométrica, levando a atribuições de resultados equivocados.

Assim, foi tomado o cuidado de realizar as análises dos embriões dos diferentes grupos de estudo em um mesmo dia. Isso evitou que diferenças de preparo da matriz, cristalização e nas condições de ionização afetassem o espectro e assim a interpretação dos resultados.

Outro cuidado que precisou ser tomado foi no momento do arredondamento das razões

m/z obtidas. A elevada proporção de hidrogênio nas estruturas químicas dos fosfolipídios leva

a um defeito de massa que varia entre 0,4 a 0,6 e pode causar erros devido ao arredondamento inadequado. Para solucionar esse problema a matriz de dados que seria analisada por quimiometria, era visualmente revisada por pessoas diferentes, garantindo com essa dupla checagem que não fosse atribuído como um íons diferente uma razão m/z consideravelmente próxima.

A identificação dos lipídeos foi realizada com auxílio do site lipidmaps.org e as atribuições foram confirmadas por meio de experimentos de MS/MS realizados no mesmo equipamento utilizando um pool de cerca de 10 embriões de um mesmo grupo de estudo.

Entretanto, em alguns casos mais de um fosfolipídio pode ser atribuído para uma mesma

m/z. Isso se deve ao fato desses lipídeos apresentarem massa nominal muito próxima ou mesmo

puderam ser distinguidas devido a resolução e exatidão de massas do equipamento Autoflex III não ser suficiente para tal.

Esse fato poderia ser investigado de forma mais profunda utilizando um pool de embriões de um mesmo grupo, para análise do perfil lipídico por ESI FT-ICR MS permitindo a obtenção do espectro com altíssima resolução e exatidão de massas. Entretanto essa análise não foi realizada devido à necessidade de um número elevado de embriões para a análise e a indisponibilidade de tempo do médico veterinário envolvido na produção desses embriões. Assim, o trabalho foi publicado com a atribuição de mais de um fosfolipídio possível para determinados valores de m/z.

Até que fosse estabelecido o protocolo ideal de analise a mesma foi repetida por diversas vezes, porém para fins de comparação quimiométrica foram utilizados sempre os dados obtidos em um mesmo dia de análise. A grande vantagem dessa técnica é que ela permite a detecção do perfil lipídico de cada embrião individualmente utilizando uma quantidade baixa de amostra.

Esse trabalho deu abertura em nosso grupo de pesquisa, para a colaborações com outros grupos na área de reprodução animal e humana. Outros trabalhos envolvendo analise de embriões bovinos, sêmen e meio de cultivo de embriões o seguiram77_.

Algumas dificuldades e questionamentos que surgiram durante o desenvolvimento desse trabalho nos impulsionaram para a realização de alguns testes de modo a estabelecer um protocolo ideal de análise de embriões. Esses testes resultaram na publicação do terceiro trabalho incluso nessa tese que consta no item 2.3 cujo título pode ser traduzido para o português como “Otimização da análise de perfil de embrião único por espectrometria de massas”.

Esse trabalho mostrou que o meio de condicionamento do embrião antes da análise, o solvente empregado na lavagem e o tempo de permanência são fatores que afetam consideravelmente a qualidade dos espectros adquiridos. Foi também avaliado a utilização de uma matriz binária (combinando DHB, CHCA, ácido trifluoroacetico e piperidina) que possibilitou a análise em modo positivo e negativo no mesmo embrião.

Os resultados obtidos com essa matriz mostraram-se bastante promissores, sendo possível detectar um número maior de lipídeos aumentando a quantidade de informação para a caracterização do modelo estudado. Entretanto, nesse trabalho os embriões foram utilizados apenas para a demonstração da metodologia e não foram investigados embriões provenientes de grupos diferentes tais como os empregados no trabalho anterior que já estava publicado a época.

Os lipídeos têm um papel muito importante em diversos processos celulares e nos tecidos. Sabe-se hoje que diversas doenças estão relacionadas a problemas no metabolismo de lipídeos. Por este motivo cada vez mais busca-se ferramentas que possibilitem a análise desses compostos levando a uma mais completa caracterização dos sistemas biológicos. A análise de lipídeos por espectrometria de massas vem sendo cada vez mais empregada devido a alta sensibilidade e especificidade da técnica78.

Os trabalhos apresentados utilizando a análise do perfil lipídico de embriões podem contribuir consideravelmente para o desenvolvimento da área de reprodução humana e animal por meio de um maior entendimento desses sistemas biológicos.

Uma outra abordagem bastante empregada ultimamente para a análise de lipídeos consiste no imageamento por espectrometria de massas. Essa abordagem permite análise não só de lipídeos mas também de proteínas, metabólitos e muitos outros compostos de interesse.

O imageamento por espectrometria de massas foi empregado no trabalho apresentado no item 2.4 cujo título pode ser traduzido para o português como “Imageamento de tumores por dessorção/ionização por laser nanoassistida”.

Havia em nosso grupo de pesquisa um grande interesse em dar início a uma nova linha de pesquisa na área de imageamento cujo desenvolvimento já estava bem estabelecido no exterior, porém era pouco explorada no país. Para dar início aos testes precisávamos trabalhar em parceria com grupos de pesquisa que nos fornecessem modelos de estudo sem a garantia de que obteríamos um resultado satisfatório.

Realizamos alguns testes iniciais, porém sem sucesso em amostras de tecido de câncer de mama humano e de cadelas. A grande dificuldade no início consistia na escolha da técnica ideal para deposição de matriz. Não demoramos a perceber que essa seria uma etapa crucial para a obtenção de resultados satisfatórios.

A deposição de matriz sobre o tecido de forma direta gerava imagens disformes que mostravam claramente que a deposição não havia sido feita de forma homogênea, formando regiões onde a matriz estava mais concentrada e outras, em contrapartida onde a mesma estava diluída. Porém, esses testes iniciais serviram para que ganhássemos experiência na manipulação do software específico (FlexImaging – Bruker). Embora exista um equipamento especifico para a deposição de matriz (ImagePrep – Bruker), infelizmente, devido ao elevado custo e a dúvida se o mesmo funcionaria de forma adequada para nossas aplicações não foi possível utilizá-lo para teste.

Nesse contexto, a análise de lipídeos por NALDI surgiu como uma alternativa nessa fase onde a deposição de matriz ainda era um desafio. A técnica emprega uma placa especifica (que tínhamos disponível no laboratório) que contém uma camada superficial de material nanoestruturado que auxilia no processo de dessorção/ionização dos compostos presentes na amostra.

Entretanto não sabíamos ao certo se a análise funcionaria, visto que a placa de NALDI que era comercializada pela Bruker não é específica para o uso em imageamento tais como as lâminas ITO condutoras, também comercializadas por eles, porém que são feitas para utilização em MALDI exigindo assim o uso de matriz nas análises. Não sendo uma placa específica para imageamento a placa de NALDI, embora fosse consideravelmente menor, assemelhava-se a placa de MALDI convencional, contendo círculos para deposição da amostra (spots).

A aquisição de imagens utilizando o software FlexImaging envolve inicialmente a calibração da posição da placa dentro do equipamento, os pontos de calibração são bem determinados na placa específica para o uso em imageamento. No caso da placa de NALDI esses pontos são apenas aproximados podendo gerar diferenças no momento da aquisição, sendo necessário assim sempre se estabelecer uma área de análise levemente maior que a área demarcada na fotografia da placa contendo o material que está em estudo.

No trabalho desenvolvido, a colaboração com a faculdade de enfermagem da USP de Ribeirão Preto possibilitou a obtenção de duas amostras de tecido tumoral, tratado e não tratado com uma droga em desenvolvimento (fosfoetanolamina). Esses tecidos ficaram a nossa disposição para testes. Os mesmos foram cortados em um criostato no instituto de biologia da Unicamp e manipulado por um membro do nosso grupo de pesquisa que possuía experiência