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A abundância de carboidratos na natureza e suas diversas funções nos sistemas biológicos justificam a importância dos estudos direcionados à química e à biologia dessas moléculas.

Os carboidratos são encontrados como monômeros ou oligômeros, ou ainda como componentes de biopolímeros e de outras substâncias encontradas naturalmente. Na células podem existir em variadas formas, como por exemplo, peptido- e proteoglicanas, glicoproteínas, ácidos nucléicos, lipopolissacarídeos ou glicolipídeos (SZNAIDMAN, 1999). A maior parte dos carboidratos estão ligados a cadeias laterais de resíduos de asparagina por meio de ligações N-glicosídicas ou a cadeias laterais de serina ou treonina através de ligações

O-glicosídicas. As ligações O-glicosídicas com os aminoácidos tirosina e hidroxilisina, bem como ligações C-glicosídicas com resíduos de triptofano são menos comumente encontradas.

Inúmeros processos celulares, tais como, reconhecimento e adesão celular, transporte intracelular e intercelular de produtos genéticos, controle de permeabilidade de membrana e reconhecimento molecular, estão diretamente relacionados à natureza de moléculas de carboidratos expressas em superfícies celulares. Determinantes de grupos antigênicos (ABH, etc.), antígenos associados a tumores (Lex, Ley, etc.), e sítios de ligação de patógenos são

alguns dos relevantes glicoconjugados encontrados em células de mamíferos. A glicosilação de proteínas, tornando-as O-ligadas a moléculas de açúcar, facilita a comunicação celular por direcionar a expressão de moléculas de carboidratos no citosol e na superfície celular, sendo essencial para a homeostase celular, balanço hormonal e resposta imune. Anormalidades no processo de glicosilação estão associadas à determinadas doenças, tais como epítopos T e Tn

relacionados à fibrose cística e câncer, e com a proteína-t na doença de Alzheimer(SCOTT et al., 2001).

As glicoproteínas ocorrem naturalmente em várias formas (glicoformas), as quais possuem a mesma estrutura peptídica, mas diferem tanto na natureza quanto no sítio de glicosilação (RADEMACHER, 1998). As funções e a versatilidade das glicoproteínas são inúmeras, considerando-se a habilidade que possuem em transmitir importantes informações, além de outras potenciais aplicações. Como por exemplo, as glicoproteínas estão envolvidas em processos fisiológicos que variam, desde a endocitose mediada por receptores, até a interação e invasão de patógenos, com conseqüente liberação de biomoduladores pelo organismo invadido(DAVIS, 2002).

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Desta forma, o campo da glicobiologia tem crescido intensamente assim como o interesse pelo desenvolvimento de métodos para a síntese de glicoconjugados. Glicopeptídeos sintéticos (fragmentos de glicoproteínas) são necessários para o estudo de interações de ligação de glicoproteínas, adesão celular e especificidade de ligação a receptores. Recentes progressos nessa área têm sido marcantes; moléculas de carboidratos relativamente complexas têm sido covalentemente ligadas a aminoácidos para incorporação em seqüências de glicopeptídeos, como por exemplo, fragmentos de mucina, fragmentos de receptores de interleucina-8, haptenos de células T-helper, fragmentos de antígenos CD52, e seqüências de fibronectinas oncofetais (SCOTT et al., 2001).

A síntese de glicoconjugados e carboidratos complexos envolve, freqüentemente, a manipulação seletiva de grupos funcionais semelhantes, com emprego de estratégias de proteção/desproteção, que conduzem ao aumento do número de etapas da seqüência sintética. A síntese de oligossacarídeos requer a diferenciação de diversos grupos hidroxílicos com reatividade similar, e obtenção de produtos com régio e estereosseletividade desejadas, uma vez que a cada glicosilação é gerado um novo centro estereogênico. Por esta razão, não existe um sistema automatizado adequado para a síntese de carboidratos, como ocorre para proteínas e ácidos nucléicos(SEEBERGER, 2000).

A metodologia mais eficaz desenvolvida até o momento para a preparação de glicopeptídeos envolve a combinação da síntese de peptídeos em fase sólida com o possível acoplamento de blocos de construção, contendo resíduos de aminoácidos previamente ligados a unidades de açúcar, com a glicosilação enzimática. A utilização de enzimas, tais como glicosiltransferases e glicosidases, conduz à formação de ligações glicosídicas de forma estéreo e regioespecífica, sem a necessidade do emprego de grupos protetores como na síntese química tradicional (MELDAL et al., 1994; TOLBORG et al., 2002). Desta forma, torna-se possível a obtenção de oligossacarídeos ou glicoconjugados de interesse biológico, em alto rendimento (KOELLER; WONG, 2000).

1.4.1. Modelagem molecular aplicada ao estudo das interações carboidrato-proteína As moléculas de carboidratos são mais freqüentemente e especificamente reconhecidas por proteínas denominadas lectinas, sendo que estas interações podem mediar uma resposta biológica específica, tais como interações parasita-hospedeiro, fertilização, doenças auto- imune e diferenciação celular. Desta forma, a investigação de como monossacarídeos ou oligossacarídeos são reconhecidos a nível molecular por sítios de ligação como lectinas, enzimas ou anticorpos é de fundamental relevância (POVEDA; BARBERO, 2005).

Interações de proteína-carboidrato possuem complexa termodinâmica, e, de modo geral, a posição específica de apenas alguns grupos hidroxílicos das moléculas de carboidrato determinam suas afinidades de ligação. Estas interações são relativamente fracas, na ordem de milimolar, se comparadas a determinadas interações proteína-proteína, como antígeno- proteína, que são da ordem de nanomolar (RAMKUMAR et al., 1995). Dados estruturais e termodinâmicos relativos a complexos de proteína-carboidrato são prontamente disponíveis, principalmente a partir de técnicas de espectroscopia de RMN e cristalografia de raio-X. A relativa contribuição de termos entálpicos e entrópicos para a energia livre de formação destes complexos possui grande variação dependendo do tipo de receptor bem como das ligações de diferentes ligantes ao mesmo receptor. Apesar da natureza hidrofílica dos carboidratos, a maior parte dos dados experimentais a partir de complexos de proteína-carboidrato sugerem que interações hidrofóbicas, principalmente entre faces hidrofóbicas das unidades de açúcar com resíduos aromáticos de triptofano e tirosina, são importantes, pois estabilizam estes complexos (LAEDERACH; REILLY, 2005). Outros fatores adicionais relacionados à afinidade de ligação de um determinado complexo proteína-carboidrato são a formação de ligações de hidrogênio intermediadas por moléculas de água, as quais podem estabilizar o complexo, e a inerente flexibilidade da molécula de carboidrato, o que permite sua ligação à proteína em diferentes conformações. Existem, no entanto, complexos nos quais a molécula de carboidrato pode assumir somente uma conformação mais estável, ao menos próximo do sítio de ligação (ALESHIN et al., 1996). Isto possibilita o emprego de abordagens como o

docking molecular para o estudo das interações proteína-carboidrato.

1.4.2. Docking molecular

As técnicas de docking, desenvolvidas para encontrar a melhor orientação e conformação de um ligante no seu sítio receptor, vêm sendo há algum tempo empregadas no processo de planejamento e desenvolvimento de fármacos. A etapa de ligação entre um fármaco e o seu alvo macromolecular protéico é um processo complexo por natureza. Fatores entrópicos e entálpicos influenciam, sobremaneira, as interações formadas. A flexibilidade do ligante e da proteína, o efeito do ambiente protéico na distribuição de cargas no ligante e as interações que podem ocorrer com as moléculas de água presentes no meio são aspectos que dificultam ainda mais a descrição detalhada desse processo. A idéia geral contida nas técnicas de docking é a de gerar um leque de conformações do complexo ligante-proteína e ordená-las por escore com base em suas estabilidades (ALONSO; BLIZNYUK; GREADY, 2006).

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Uma das características mais valiosas de docking é a sua capacidade de reproduzir modos de ligação observados experimentalmente, como uma forma de validação do método empregado. Para realizar um teste desse nível, um ligante é extraído de seu complexo cristalográfico e submetido a simulações de docking com o sítio ligante da proteína. Dessa forma, os modos de ligação gerados nas simulações são comparados com os respectivos modos de ligação obtidos experimentalmente. Outra possibilidade inerente ao método é a capacidade de sua função de escore de ordenar ligantes de acordo com valores experimentais de atividade. Essa correlação é feita através dos valores de escore obtidos nas simulações e os valores experimentais de atividade, como por exemplo IC50 (VERDONK et al., 2003).

De maneira geral, os softwares de docking são formados por uma combinação de dois componentes: um algoritmo de busca e uma função de escore (VERDONK et al., 2003). O algoritmo é utilizado na busca de possíveis modos de ligação, e permite explorar os graus de liberdade translacional e rotacional do ligante, bem como os graus de liberdade conformacional de ambos, ligante e proteína. A função de escore é aplicada para tentar distinguir os modos de ligação mais próximos dos obtidos experimentalmente entre os demais modos de ligação explorados pelo algoritmo de busca e, dessa forma, ordenar os diferentes modos de ligação apresentados. As funções de escore podem ser estabelecidas de acordo com campos de força de mecânica molecular, parâmetros empíricos de cálculos de energia livre ou até de acordo com parâmetros denominados knowledge-based.

Uma das aplicações dos softwares de docking ocorre em screening virtual de bases de dados, situação em que amplas coleções virtuais de compostos são submetidas às simulações de docking em um sítio ligante protéico e os respectivos compostos são ordenados de acordo com a afinidade pelo alvo macromolecular, sugerida pela função de escore (SCHNEIDER; BÖHM, 2002). A abordagem de screening virtual contribui bastante no processo de desenvolvimento de fármacos, pois compostos com potencial de interação com o sítio ligante estudado podem ser futuramente investigados com maior precisão, reduzindo drasticamente o tempo de identificação de protótipos quando comparada com as estratégias convencionais.

1.4.2.1. Algoritmo genético e software GOLD

O algoritmo genético é constituído por parâmetros de otimização que mimetizam o processo de evolução e seleção natural, onde os indivíduos representam as conformações em determinado espaço conformacional. Este algoritmo realiza uma busca paralela do espaço conformacional ao invés de ponto a ponto como realizam outros métodos. Um conjunto de conformações (cromossomos) que codificam variedades distintas de um sistema é gerado e

este conjunto se recombina, sendo selecionadas as melhores conformações. Em períodos de tempo determinados são produzidas mutações e inversões e os processos de recombinação e seleção continuam até que não exista nenhuma nova conformação de baixa energia dentro de um espaço estabelecido. Os parâmetros de algoritmo genético são especialmente efetivos em moléculas flexíveis com ligações rotacionáveis (GOLDBERG, 1989).

O algoritmo genético é provavelmente o mais aplicado ao docking molecular e é implementado no software GOLD, descrito por Jones et al. (JONES et al., 1997). Assim como outros programas de docking, o GOLD é constituído por três partes principais (VERDONK et al., 2003):

1. Uma função de escore denominada Goldscore para ranquear os diferentes modos de ligação, sendo esta uma função de mecânica molécular;

2. Um mecanismo para o posicionamento do ligante no sítio ativo; o GOLD utiliza um método único para isto, o qual é baseado em pontos de interação (fitting points); ele adiciona pontos de interação para grupos capazes de realizar ligações de hidrogênio na proteína e no ligante, e mapeia pontos do aceptor no ligante ou pontos do doador na proteína e vice-versa. Adicionalmente, o GOLD gera pontos de interação hidrofóbica na cavidade da proteína na qual grupos CH do ligante são mapeados; 3. Um algoritmo de busca para explorar os possíveis modos de ligação; GOLD utiliza o

algoritmo genético no qual os seguintes parâmetros são modificados/otimizados: a) diedro das ligações rotacionais do ligante; b) geometria dos anéis do ligante; c) diedro dos grupos OH e NH3+ e d) mapeamento dos pontos de interação, ou seja,

posição do ligante no sítio ativo.

Os parâmetros do algoritmo genético afetam o tempo da simulação de docking e a probabilidade de se encontrar uma orientação de mais baixa energia do ponto de vista do complexo. O número de dockings e o número de operações de algoritmo genético em cada um destes dockings são os principais parâmetros que afetam o tempo da simulação e a exatidão dos resultados.

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