Le mode d’action du PARST

Les résultats précédents ont montré que le PARST bloque la transcription des gènes du SSTT. Or, la transcription et la sécrétion sont couplées (Urbanowski et al., 2005). Donc, le PARST inhibe-t-il aussi la sécrétion des exotoxines ?

119 ExsA est l’activateur transcriptionnel de l’ensemble des gènes du SSTT. Cette protéine est la pièce maîtresse dans la régulation de ce système. De ce fait, nous avons décidé de vérifier si le PARST agit en amont ou en aval de l’action d’ExsA.

Nous avons préparé deux souches rapportrices : CHA(pSlux)::pexsAind et CHA(pClux)::pexsAind. Elles contiennent le plasmide pexsAind (Filopon et al., 2006) qui est inductible à l'IPTG. Il permet une expression en trans de la protéine ExsA (figure 21). Ces deux souches rapportrices permettent de mesurer l’activité transcriptionnelle des deux gènes exoS et exsA par mesure de la bioluminescence émise par les bactéries possédant l’opéron luxCDABE. En effet, Les promoteurs de l’opéron exsCEBA et du gène exoS ont été fusionnés en amont de l’opéron luxCDABE sans promoteur. Chacune des fusions transcriptionnelle a ensuite été intégrée dans le chromosome de la souche CHA (cf. § III. 11. de la partie matériel et méthodes). Des unités relatives de luminescence rapportées à la DO600, permettent d’estimer l’activité transcriptionnelle du promoteur.

Figure 21 : Le plasmide pexsAind. Le plasmide pexsAind permet une expression en trans de l’activateur transcriptionnel ExsA. Cette expression est sous le contrôle du promoteur placZ inductible à l’IPTG. Le gène

bla permet une résistance à la carbiniciline (Filopon et al., 2006).

Afin d’analyser les effecteurs du SSTT par SDS-PAGE, une culture de 16 heures de chacune des deux souches a été lavée deux fois, le milieu LB a été inoculé à une DO600 de 0,2.

120 Les bactéries ont été cultivées en présence de la carbéniciline à 300 µg/mL et dans les conditions d’induction du SSTT (5 mM EGTA et 20 mM MgCl2). Différentes conditions ont été testées :

� Présence ou non du PARST (surnageant issu d’une culture de la souche sauvage CHA en phase stationnaire de croissance)

� Induction ou non à l’IPTG (5mM) du facteur de transcription ExsA

Après 3 heures de cultures (DO600 entre 1,5 et 2), la luminescence a été mesurée et les surnageants ont été récupérés. Une précipitation à l’acide perchlorique à 15% a été réalisée comme décrit dans la partie matériel et méthodes (cf. § 4. 3. 1.). Par une centrifugation de 15 minutes à 15000g, les protéines ont été collectées. Après deux lavages à l’acétone, les protéines ont été séchées et resuspendues dans le tampon de dépôt du SDS-PAGE. Après dénaturation à 95°C, les échantillons ont été analysés par SDS-PAGE à 12%. La quantité des protéines déposées a été normalisée par rapport à la DO600 de la culture. Les protéines du culot bactérien ont été aussi analysées. En utilisant un anticorps anti-ExoS/ExoT, des Western blots ont été réalisés afin de détecter l’exotoxine S et/ou T dans les échantillons analysés (surnageant et culot).

La figure 22 (A.1 et B.1) montre qu’en absence d’IPTG le PARST inhibe la transcription des gènes du SSTT. L’ajout d’IPTG est à l’origine d’une forte activité transcriptionnelle. Pour la souche CHA(pClux)::pexsAind, en présence du PARST, cette activité reste intacte. Cependant, pour la souche CHA(pSlux)::pexsAind, cette activité est moins forte -en présence du PARST- mais reste largement supérieure (200%) par rapport à celle obtenue en absence simultanée d’IPTG et du PARST.

En utilisant un anticorps anti-ExoS/ExoT, une immunodétection des exotoxines ExoS et ExoT a été réalisée sur les protéines du surnageant et du culot bactérien correspondant à chaque condition. Pour les deux souches, les résultats (A. 2 et B. 2) montrent que :

� En absence du PARST, les exotoxines sont secrétés dans le surnagent et très peu de protéines sont détectées dans le culot cellulaire

� En présence du PARST (flèches rouges sur la figure), les exotoxines ne sont pas détectées ni dans le surnageant (ou très peu) ni dans le culot cellulaire, ceci même en présence d’IPTG.

121 Figure 22 : Le PARST agit au niveau post-transcriptionnel. Les souches sauvages CHA(pClux)::pexsAind (A) et CHA(pSlux)::pexsAind (B) ont été cultivée à 37°C dans le LB sous les conditions d’induction du SSTT (5 mM EGTA et 20 mM MgCl2). Ceci en présence ou non d’IPTG à 5Mm et d’un surnageant (PARST) issu d’une culture en phase stationnaire de la souche CHA. La luminescence (RLU) a été mesurée (A. 1 et B. 1) pour une DO600 comprise entre 1,5 et 1,8. Les valeurs de RLU sont normalisées par rapport à la DO600 et les valeurs représentent la moyenne (± l’erreur standard) d’au moins trois expériences indépendantes. A. 2 et B. 2 : Les surnageants cellulaires ont été précipités au PCA à 15%. Les protéines des surnageants et des culots cellulaires ont été séparées par SDS-PAGE à 12% après une normalisation. En utilisant un anticorps anti-ExoS/ExoT, Un wester blot a été réalisé pour détecter les exotoxines S et T aussi bien dans le surnageant que dans le culot cellulaire.

122 En présence du PARST et d’IPTG simultanément :

� Il y a une forte activité transcriptionnelle des deux gènes exsA et exoS

� Mais les exotoxines sont absents dans le surnageant et le culot cellulaire

Par conséquent il est possible que le PARST soit à l’origine d’une répression de la traduction et une dégradation des ARNm messagers des protéines du SSTT. Donc le PARST pourrait exercer une régulation post-transcriptionnelle. Ceci en plus d’une inhibition de la transcription des gènes du SSTT.

Afin d’expliquer les mécanismes à l’origine de l’inactivation de certains facteurs de virulence dont le SSTT, plusieurs modèles de régulation post-transcriptionnelle ont été proposés (Ventre et al., 2006, Goodman et al., 2004, Heurlier et al., 2004). Ces modèles font intervenir des systèmes à deux composants employant des petits ARN non codants (cf. partie introduction).

Figure 23 : Voies régulant les facteurs de virulence au cours d’une transition entre infection aigue et infection chronique. Ces voies font intervenir des systèmes à deux composantes (RetS, LadS et GacS/A) et un petit ARN non codant (RsmZ) (Ventre et al., 2006 ).

En suivant le modèle proposé par Ventre et al., 2006 (figure 23), notre hypothèse est la suivante : comme le PARST est un répresseur du SSTT, il stimule la voie de transduction du signal initiée par le système LadS. Cette voie provoque l’activation du système GacS/GacA qui à son tour stimule la formation du petit ARN non codant RsmZ. Ce dernier se lie à la protéine RsmA qui est une protéine se liant aux petits ARN non codants. RsmY est un autre petit ARN non codant qui peut aussi interagir avec la protéine RsmA (Valverde et al., 2003).

123 Cette liaison entre RsmZ ou RsmY et RsmA est à l’origine d’une déstabilisation des ARNm issus de la transcription des gènes du SSTT.

Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons essayé de préparer des souches rapportrices avec délétion dans l’un des gènes suivants : ladS, retS, gacS, gacA, rsmZ, rsmY et rsmA. Malheureusement après plusieurs essais, nous n’avons pas pu obtenir les mutants appropriés. D’autre part, ces mutants ont été utilisés par d’autres équipes de recherche, mais nous n’avons pas pu les avoir. De ce fait, nous avons commandé auprès de l’Université de Washington (www.gs.washington.edu, www.pseudomonas.com), la souche sauvage MPAO1 et les mutants de transposition : PAO1∆gacA, PAO1∆gacS, PAO1∆retS et PAO1∆ladS. Bien que ces souches possèdent tous les gènes codant pour le SSTT, l’induction de ce dernier s’est avérée très faible ou presque nulle. Il est possible que le SSTT de ces souches est non inductible car beaucoup de souches perdent cette inductibilité par des mécanismes épigénitique (cf. partie introduction, chapitre 3, § 9. 2. 1.).

À l’issue de cette première série de travaux, notre avons constaté que le PARST exerce une régulation de l’expression du SSTT de type post-transcriptionnelle. En effet, les gènes du SSTT sont transcrits mais les ARNm ne sont pas traduits et sont probablement dégradés. Il est possible que le récepteur du signal PARST soit la protéine LadS car la voie médiée par cette dernière est à l’origine d’une inactivation du SSTT.