Le milieu intracellulaire : rôle dans la sélectivité

Le milieu intracellulaire peut conférer une sélectivité pour un métal donné à

une voie métabolique. Par exemple, quand la protéine NmtR de Mycobacterium

tuberculosis lie Ni

(II)

ou Co

(II)

, elle devient active. D’après l’étude de Cavet et

al. [Cavet et al., 2002], quand cette protéine est exprimée dans une cyanobactérie,

elle perd toute sensibilité au Ni

(II)

qui est pourtant son effecteur allostérique le plus

puissant. Elle est produite, accumulée dans le cytoplasme, fonctionnelle, compétente

pour détecter la présence de cobalt(II), néanmoins totalement incapable de détecter

le nickel, même à des concentrations létales. Cette observation révèle l’existence

d’une sélectivité pour le nickel induite par le cytosol hôte. Clavet et al. propose

l’existence d’une métallochaperone à Ni

(II)

, cytosolique, partenaire de NmtR, qui

3.3. Les déterminants de la sélectivité 35

permet à NmtR de complexer le métal. Cette métallochaperone est absente du

cytosol de la cyanobactérie.

La sélectivité du magnésium par rapport au zinc procède également en partie du

milieu cellulaire. De nombreuses protéines ont opté pour Mg

2+

comme cofacteur car

il est extrêmement abondant dans la cellule. Pourtant, ce ne sont pas les protéines

qui ont évolué pour sélectionner le magnésium des autres cations car Zn

(II)

peut, par

exemple, facilement le déplacer des sites où il est lié.

A la place, c’est la machinerie cellulaire qui s’est développée pour contrôler la

sé-lectivité des protéines pour les métaux en régulant les concentrations de Mg

2+

et

Zn

2+

et en adressant les cations métalliques vers les protéines et les compartiments

intracellulaires où ils sont nécessaires [Dudev et Lim, 2001].

Chapitre 4

Objectifs de la Thèse

P

lusieurs structures tridimensionnelles de métallochaperones et de domaines

de liaison des métaux de leurs ATPases cibles sont désormais disponibles. Ces

structures ont été résolues dans diverses conditions, en présence ou en absence

d’ion métallique chélaté. Il est intéressant de noter que parmi les holoprotéines dont

la structure est connue, plusieurs ne comportent pas le métal qu’elles transportent

in vivo. Ainsi, on dispose de structures d’Atx1 liées au Cu

(I)

, mais aussi au Hg

(II)

, ou

d’Hah1 complexant un ion Cu

(I)

, Hg

(II)

ou Cd

(II)

.

Le chapitre 2 a montré l’existence d’une grande homologie de séquence et de

structure entre les diverses métallochaperones à cuivre, mais également à mercure.

La question de la sélectivité des métallochaperones se posent donc. Plusieurs aspects

de la sélectivité des métalloprotéines pour un métal ont été abordé au chapitre 3 et

conduisent à se demander comment des protéines aussi proches dans leurs structures

primaires, secondaires et tertiaires que les métallochaperones de la famille d’Atx1 et

de MerP, peuvent transporter spécifiquement du Cu

(I)

ou du Hg

(II)

dans la cellule, et

complexer, a priori aussi facilement (du moins in vitro), des métaux sans lien avec

leur fonction biologique.

L’étude qui suit a ainsi cherché à déterminer quelles propriétés pouvaient

suppor-ter la sélectivité de la complexation du Cu

(I)

et du Hg

(II)

par les protéines Atx1, Hah1

et MerP. Une étude de type structure-dynamique-sélectivité a donc été entreprise.

L’intérêt d’étudier ces trois protéines permet d’effectuer une analyse croisée de la

sélectivité : Atx1 et Hah1 sont des métallochaperones à cuivre, alors que MerP en

est une à mercure. Les méthodes mises en œuvre sont la simulation de dynamique

moléculaire pour une grande part, et l’absorption de rayons X.

La dynamique moléculaire est une méthode qui permet d’analyser des propriétés

structurales et dynamiques des molécules simulées de façon très précise. Des

potentiels d’interaction entre un Cu

(I)

ou un Hg

(II)

ont été développés au laboratoire

[Fuchset al., 2005], et utilisés dans les simulations. Chaque protéine a été simulée

sous trois formes : apo, liée au Cu

(I)

et liée au Hg

(II)

. A partir de ces simulations,

une étude comparative entre les divers états d’une même protéine, et entre les

trois protéines a été menée pour tenter d’identifier des propriétés fondamentales

38 4. Objectifs de la Thèse

pouvant être reliées à la sélectivité pour le Cu

(I)

ou le Hg

(II)

dans Atx1, Hah1 et MerP.

On dispose de données précises sur l’environnement du Cu

(I)

dans Hah1 grâce

aux expériences d’absorption de rayons X de Ralle et al. [Ralle et al., 2003]. On sait

que dans certaines conditions, le Cu

(I)

est dans une géométrie linéaire quand il est

complexé par Hah1. A l’inverse, CopZ de Bacillus subtilis ne chélate le Cu

(I)

que

dans un environnement trigonal [Banciet al., 2003b]. Concernant Atx1, depuis les

expériences d’absorption de rayons X de Pufahl et al. [Pufahl et al., 1997], un doute

subsiste sur le site de chélation du Cu

(I)

. Il est supposé trigonal, mais cette

géomé-trie est certainement imposée par un réducteur (le DTT) dans le milieu. De plus,

le criblage de structures organo-métalliques dans la Cambridge Structural Database

[Allen et al., 1979] montre que le Cu

(I)

tend préférentiellement à développer des

coor-dinations avec 3 ou 4 ligands, moins souvent avec 2. Par conséquent, afin de statuer

sur le mode de coordination du Cu

(I)

, de nouvelles expériences d’absorption de RX

ont été réalisés et confrontées aux résultats des simulations. Cela a conduit à proposer

un modèle de sélectivité du Cu

(I)

pour Atx1, in vitro etin vivo.

Deuxième partie

Outils & Méthodologies

Chapitre 5

La Dynamique Moléculaire

Sommaire

5.1 La mécanique moléculaire . . . . 43

5.1.1 Principe . . . . 43

5.1.2 Le champ de forces . . . . 44

5.1.3 Paramétrisation de charmm . . . . 47

5.1.4 Nouveaux paramètres pour l’interaction cystéine–métal . . . 50

5.2 La dynamique moléculaire . . . . 54

5.2.1 Dynamique newtonienne . . . . 54

5.2.2 Dynamique de Langevin . . . . 56

5.3 Techniques numériques de dynamique moléculaire . . . . 57

5.3.1 Intégration du temps . . . . 57

5.3.2 Conditions initiales . . . . 58

5.3.3 Durée du pas de temps . . . . 59

5.3.4 Conditions aux limites . . . . 59

5.3.5 Traitement des interactions à longue distance . . . . 60

5.3.6 Contrôle de la température . . . . 65

5.3.7 Contrôle de la pression . . . . 66

5.4 Protocole de simulation . . . . 67

5.5 Analyse des simulations de dynamique moléculaire . . . 69

5.5.1 RMSD et RMSF . . . . 69

5.5.2 Carte des corrélations croisées dynamiques . . . . 70

5.5.3 Liaisons hydrogène . . . . 71

5.5.4 Repliement des protéines . . . . 71

5.5.5 Accessibilité au solvant . . . . 73

5.5.6 Estimation de l’erreur statistique sur une moyenne . . . . . 73

42 5. La Dynamique Moléculaire

L

a cristallographie de rayons X (RX) et la résonance magnétique nucléaire

(RMN) permettent aujourd’hui d’obtenir de nombreuses structures de

molé-cules de complexes biologiques (protéines, acides nucléiques, complexes

nu-cléoprotéiques, etc). Ces structures dont le nombre croît rapidement, sont librement

disponibles sur le site de la Protein Data Bank

1

[Berman et al., 2000]. Résoudre une

structure consiste à déterminer les coordonnées tridimensionnelles des atomes de la

molécule d’intérêt. Néanmoins, il ne faudait pas considérer les molécules biologiques

comme des édifices figés. L’image statique des structures suggérée par les positions

atomiques(x, y, z)doit être abandonnée au profit d’une représentation dynamique des

molécules où les atomes sont en mouvement constant. Ces mouvements peuvent être

locaux et rapides, ou collectifs et plus lents, impliquant ainsi des groupes d’atomes

voire des domaines entiers de la molécule. Ils créent donc un ensemble de

conforma-tions possibles pour la molécule donnée à une température donnée. Le tableau 5.1

adapté de [McCammon, 1984] donne une classification de l’ensemble des mouvements

internes des protéines.

Types de mouvements Etendue Amplitude Temps

spatiale caractéristique

(nm) (nm) (s)

Vibration relative d’atomes liés 0.2-0.5 0.001-0.01 10

⁻¹⁴

-10

⁻¹³

Vibration élastique de région globulaire 1-2 0.005-0.05 10

−12

-10

−11

Rotation des chaînes latérales en surface 0.5-1 0.5-1 10

−11

-10

−10

Libration torsionnelle de groupes enfouis 0.5-1 0.0.5 10

−11

-10

−9

Mouvement relatif de différentes régions 1-2 0.1-0.5 10

−11

-10

−7

globulaires (charnière et courbure)

Rotation de chaînes latérales de taille 0.5 0.5 10

⁻⁴

-1

moyenne à l’intérieur de la protéine

Transitions allostériques 0.5-4 0.1-0.5 10

⁻⁵

-1

Dénaturation locale 0.5-1 0.5-1 10

⁻⁵

-10

Tab.5.1– Caractéristiques de quelques mouvements de protéines (adapté de [McCammon, 1984]).

En italique, les mouvements accessibles en dynamique moléculaire.

Ces fluctuations structurales, issues de la superposition de mouvements de vitesse

et d’amplitude très différentes, contribuent à l’activité biologique des protéines et

influent sur leur capacité à lier un substrat, une protéine partenaire ou un cofacteur.

Les mouvements internes créent une variation d’une part, du volume du site de

liaison du ligand et, d’autre part, de la disposition des groupements impliqués

dans sa liaison. Ils modulent ainsi les interactions (électrostatiques, hydrophobes

et liaisons hydrogène) au sein du site de liaison de manière à rendre la protéine

plus élastique. L’exemple de l’aptitude de la myoglobine à lier O

2

et CO en est l’un

des plus connus. Dans cette protéine, la réorientation de trois chaînes latérales par

un mouvement de rotation locale permet au substrat de s’échapper de la protéine

[Karplus et McCammon, 1983].

5.1. La mécanique moléculaire 43

Il est possible d’étudier expérimentalement les propriétés dynamiques des

molé-cules biologiques. En plus des coordonnées atomiques, la diffraction de rayons X

renseigne sur une certaine dynamique des atomes grâce au facteur de Debye-Waller

(ou facteur de température), B :

B = ^8π

2

3 h(∆r)

²

i. (5.1)

Le déplacement quadratique moyen apparent _h(∆r)

2

i des atomes inclut une

contri-bution à la fois du réseau cristallin, en traduisant le désordre intrinsèque du cristal,

et des mouvements atomiques dépendant de la température (fluctuations

confor-mationnelles et vibrationnelles). Le facteur B n’apporte donc que des informations

partielles et moyennées sur l’ensemble des mailles du cristal concernant la dynamique

interne de la protéine cristallisée.

Différentes techniques expérimentales (spectroscopies de fluorescence, de RX,

neutrons, RMN etc) permettent de sonder la dynamique des protéines sur des

échelles de temps allant de la femtoseconde à la microseconde. Pour la gamme

entre la femtoseconde et la nanoseconde, une comparaison est alors possible avec la

dynamique moléculaire.

Cependant, la caractérisation expérimentale de la dynamique des protéines à

l’échelle atomique demeure difficile et incomplète tant les échelles de temps des

di-vers mouvements sont différentes, allant de la femtoseconde à la seconde, voire à

plusieurs dizaines de secondes. Une méthode alternative à l’étude in vitro des

mou-vements des protéines consiste à simulerin silico la dynamique des protéines grâce à

la modélisation moléculaire. Plusieurs approches existent, dont celle de la dynamique

moléculaire.

5.1 La mécanique moléculaire

Dans le document Structure, dynamique moléculaire et sélectivité de métallochaperones à cuivre et à mercure (Page 56-65)