Le complexe CAF-1 : activité chaperonne H3-H4

Le mécanisme par lequel les histones accèdent et s’assemblent sur l’ADN nouvellement synthétisé a commencé à être caractérisé en 1975 (Germond et al., 1975; Oudet et al., 1975). Depuis, il a été constaté que, bien que des extraits cytoplasmiques provenant de cellules 293T permettent une réplication efficace de l’ADN plasmidique, seuls les extraits nucléaires permettent un assemblage de nouveaux mini-chromosomes contenant des nucléosomes (Stillman, 1986). Ce fut cette observation qui a conduit à suggérer l’existence d’une machinerie spécifique qui suit le mécanisme de réplication au long de l’ADN et favorise l’assemblage des nucléosomes (Stillman, 1986). Trois ans plus tard le complexe CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) a été identifié et purifié (Smith and Stillman, 1989). Il s’agit d’un complexe hétérotrimérique, composé de trois sous-unités, et qui possède la capacité d’assembler des histones sur l’ADN nouvellement synthétisé. Chaque sous-unité a été nommée sur la base de son poids moléculaire apparent en électrophorèse : une sous-unité de 150 kDa (CAF-1-p150, CHAF1a), une sous-sous-unité de 60 kDa (CAF-1-p60, CHAF1b), et une sous-unité de 48 kDa (CAF-1-p48, RbAp48, p48) (Figure 29). La stœchiométrie des sous-unités est de 1:1:1. Le complexe CAF-1 contient fréquemment des dimères d’histones acétylées H3/H4 nouvellement synthétisés (Verreault et al., 1996).

Chez S. cerevisiae, CAF-1 se compose de Cac1p (Rlf2p – Rap1 protein Localisation Factor), Cac2p (Chromatin Assembly Complex) et Cac3p (Msi1p – Multicopy Suppressor of Ira1) (Tableau 12).

Organismes Grande sous-unité Sous-unité intermédiaire Petite sous-unité

H. sapiens p150, CHAF1a RbAp48, p48 RbAp48, p48

M. musculus p150 p60 p48

D. melanogaster p180 p105 p55

C. elegans Chaf1 Chaf2 Chaf3

S. cerevisiae Cac1p, Rlf2p Cac2p Cac3p, Msi1p

A. thaliana FAS1 FAS2 FAS3

Tableau 12: Comparaison des sous-unités du complexe CAF-1 chez divers organismes. Extrait de Yu et al., 2015b.

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Page 171 Figure 29 : Diagrammes des composants du complexe CAF-1 chez l’humain.CHAF1a contient un domaine N-terminal PIP (PCNA Interacting Motif), qui a une forte activité in vitro, suivi d'une région d'interaction MOD-1, qui est nécessaire pour l'interaction avec l'hétérochromatine. Dans cette région il existe un domaine d’interaction HP1 (Hétérochromatin Protéin 1), suivi d’un domaine PEST qui entraîne la dégradation rapide des protéines. Le domaine KER est une région très acide, candidate pour l'interaction avec les histones. Le domaine PIP a été montré expérimentalement comme requis pour l'interaction in vivo avec PCNA et la formation des nucléosomes. Enfin, la région ED et une région d'interaction avec CHAF1b se trouvent à l'extrémité C-terminale de CHAF1a. CHAF1b est l'une des nombreuses protéines contenant des répétitions WD. Elle contient 7 répétitions WD, suivies par un domaine PEST, ainsi que deux motifs B-domaine-like qui facilitent les interactions directes avec ASF1a. p48 est également une protéine contenant 7 répétitions WD et qui comprend également deux domaines α-hélicoïdale aux extrémités N et C terminales qui facilitent la liaison à H4. Extrait de Volk and Crispino, 2015.

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L’association de CAF-1 avec les histones nouvellement synthétisées suggère que ce complexe est impliqué dans le dépôt des histones nouvellement synthétisées sur l’ADN, par opposition aux complexes chaperonnes d’histones qui déstabilisent les histones en amont ou en aval sur l’ADN matrice (Ruiz-Carrillo et al., 1975; Sobel et al., 1995; Stillman, 1986). Dans la phase S, CAF-1 est localisée à la fourche de réplication (Krude, 1995). Cette localisation permet à CAF-1 de faciliter la première étape de la formation des nucléosomes, le dépôt de dimères H3/H4 sur l’ADN nouvellement synthétisé. Au cours de cette phase, des protéines H3 et H4 nouvellement synthétisées dans le cytoplasme forment des complexes hétérotrimériques avec la chaperonne d’histone Asf1p dans un mélange stœchiométrique 1 :1 :1 (Figure 30) (pour revue Volk and Crispino, 2015). Au sein de ce complexe, Asf1p lie H3, empêchant son homodimérisation naturelle. Ainsi, les hétérodimères H3/H4 ne s’assemblent pas en tétramères. À la suite de l’interaction avec l’ADN et l’histone H2A dans le nucléosome en cours de formation, H4 subit un changement de conformation qui libère le domaine globulaire d’Asf1p et permet la formation de l’hétérotétramère (H3-H4)2 (English et al., 2006) (Figure 30).

CAF-1 a une préférence particulière pour la forme variante d’histone H3.1, qui est produite principalement au cours de la phase S et est considérée comme étant la forme d’histone H3 dépendante de la réplication. La variante H3.2 diffère de H3.1 par un acide aminé (Cystéine substituée par une Sérine en position 96) et est également produite lors de la réplication de l’ADN, bien qu’il n’y ait aucune preuve fonctionnelle montrant les interactions avec CAF-1 (Franklin and Zweidler, 1977). Les cellules sont capables de se diviser et de se différencier quand H3.2 est totalement absente, mais qu’elle est remplacée par la forme variante H3.3 (Hodl and Basler, 2012). H3.3 est continuellement synthétisée tout au long de la durée de vie de la cellule, ses niveaux sont maintenus indépendamment de la régulation du cycle cellulaire, et elle peut être incorporée dans la chromatine à tout moment au cours du cycle cellulaire (Ahmad and Henikoff, 2002; Brown et al., 1985). Cependant, H3.3 semble préférentiellement être trouvée avec le complexe HIRA au lieu de CAF-1 (Tagami et al., 2004).

Les dimères d’histones H3/H4 nouvellement synthétisées sont acétylés dans le cytoplasme par une histone acétyltransférase de type B (HAT) qui est connue pour acétyler les résidus K5 et K12 sur les histones H4 non-liées au nucléosome (Imhof and Wolffe, 1999; Kleff et al., 1995; Parthun et al., 1996; Verreault et al., 1998).

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Page 173 Figure 30 : Structure du complexe Asf1-H3-H4. (A) Les régions des protéines Asf1, H3 et H4 qui apparaissent dans cette structure sont présentées sous forme de cases colorées représentant les protéines de pleine longueur. (B) Représentation de Asf1p avec les contacts qui se forment avec H3. Les acides aminés de l'histone H3 qui contribuent de façon importante à l'interface Asf1p sont représentés par des ovales cyan, dont les dimensions sont proportionnelles à l'étendue de la surface enterrée et sont étiquetés en conséquence. (C) Structure générale du complexe Asf1p-H3-H4, avec Asf1p en violet, H3 en cyan et H4 en vert. Les principaux éléments de la structure secondaire sont marqués. Extrait de English et al., 2006.

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Des expériences d’épuisement de CHAF1a ou de CHAF1b par shRNA conduit à la perte immédiate de l’activité chaperonne sur la chromatine et la dégradation concomitante rapide des deux autres sous-unités, très probablement en raison de l’exposition et de l’activation des domaines PEST (signal de protéolyse) (Rechsteiner and Rogers, 1996) présents dans celles-ci (Kaufman et al., 1995; Lee et al., 2009). La sous-unité p48 est critique pour la formation des nucléosomes dépendante de la réplication de l’ADN (Kadyrova

et al., 2013). Chez la levure, la perte de l’activité de CAF-1 n’est pas létale, mais conduit à la formation de fragments Okazaki plus longs, à cause d’un mauvais placement des nucléosomes, suggérant également un défaut dans la réplication de l’ADN (Smith and Whitehouse, 2012). En plus des changements de taille des fragments Okazaki, d’autres défauts réplicatifs sont observés, comme l’activation des points de contrôle mitotique dues à des défauts chromosomiques au niveau des centromères et la formation du kinétochore, en particulier lorsqu’elle est associée à des mutations supplémentaires dans les protéines HIR (Histone Regulatory) (Krude, 2002). Des études récentes ont suggéré que CAF-1 est également impliqué dans les voies de développement, mémoire épigénétique et la division cellulaire asymétrique (Huang et al., 2010; Nakano et al., 2011; Yu et al., 2013; Zeng et al., 2013).

4.3.1 La sous-unité CHAF1a

L’une des principales fonctions de CHAF1a (p150) est de diriger le complexe CAF-1 à la fourche de réplication par une interaction directe avec PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) (Shibahara and Stillman, 1999). PCNA forme un complexe coulissant sur l’ADN lors de la synthèse de l’ADN, et sert d’échafaudage pour plusieurs protéines différentes, dont les ADN polymérases et des chaperonnes d’histones (Maga et al., 1999; Maga et al., 2000; Shibahara and Stillman, 1999). Bien que CHAF1a ait deux domaines peptidiques séparées mais conservés interagissant avec PCNA (PIP, PCNA Interacting Peptide), le second PIP (PIP2), situé vers le milieu de la protéine, est principalement responsable de l’interaction in vivo avec PCNA. Les deux PIP de CHAF1a ont des affinités différentes pour PCNA, car le motif PIP1 en N-terminal lie fortement PCNA dans des études in vitro, mais semble être inutile dans un contexte cellulaire. En revanche, PIP2 est nécessaire pour la liaison de PCNA

in vivo et diffère de PIP1 par un seul acide aminé (Q-K) (Rolef Ben-Shahar et al., 2009). Alors qu’une région PIP2 potentielle a été identifiée dans CHAF1b, des expériences ultérieures ne révèlent aucune preuve de la liaison directe avec PCNA. Il a été proposé que les régions du PIP de CHAF1a interférent avec l’activité des nucléosomes plutôt que directement avec les processus de réplication de l’ADN, ce qui permet à CAF-1 de

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fonctionner derrière la fourche de réplication, sans empêcher d’autres processus médiés par PCNA (Rolef Ben-Shahar et al., 2009).

En plus de son rôle dans la réplication de l’ADN en phase S, CHAF1a est également impliquée dans la réparation des dommages de l’ADN en interphase, en particulier pendant la réparation NER (nucléotide excision repair) dans un processus dépendant de l’ATP impliquant PCNA (Moggs et al., 2000). CHAF1a a aussi des fonctions supplémentaires dans la réparation de l’ADN mais de manière indépendante de PCNA pendant la réparation DSB (double strand break). Dans la réparation DSB, CHAF1a est enrichie à des sites DSB par une interaction directe PCNA-indépendante avec les protéines 14-3-3ζ et KU70/80 (également connu comme Complexe Protein Kinase ADN-dépendant) (Hoek et al., 2011). Ce complexe est connu pour recruter les facteurs nécessaires à la réparation des DBS et facilite le mécanisme de jonction des extrémités non homologues (NHEJ, Non-homologous end joining) et la recombinaison homologue (Lees-Miller, 1996).

CHAF1a peut également interagir avec le facteur HP1 (Heterochromatin-binding Protein 1), permettant au complexe CAF-1 de cibler l’hétérochromatine par l’intermédiaire d’un domaine de liaison HP1 à l’extrémité N-terminale de CHAF1a qui est situé dans la région d’interaction Mod (Murzina et al., 1999; Quivy et al., 2008). L’extrémité N-terminale de CHAF1a abrite également un fragment qui est suffisant pour maintenir l’association des régions chromosomiques et des protéines associées avec les nucléoles, y compris la liaison avec l’antigène de prolifération Ki67, avec la nucléophosmine et la nucléoline. Cependant, ce fragment est incapable d’interagir avec CHAF1b, suggérant que cette fonction nucléolaire est très probablement indépendante de CAF-1, et ne comporte pas d’activité histone chaperonne (Smith et al., 2014).

4.3.2 La sous-unité p48

La sous-unité p48 a initialement été caractérisée comme membre de la famille des protéines du rétinoblastome (Rb) chez la levure dans des expériences de chromatographie d’affinité et a ensuite été séquencée et rebaptisée protéine associée au rétinoblastome p48 (RbAp48) (Qian and Lee, 1995; Qian et al., 1993). P48, se compose de 7 répétitions WD et interagit avec H4 indépendamment de CAF-1 par des domaines alpha-hélicoïdale situés à son extrémité N et C-terminale (Zhang et al., 2013a). Elle est également étroitement associée à la sous-unité catalytique de l’histone déacétylase humaine HDAC1, ce qui avait suggéré un rôle dans la déacétylation des histones H4 nouvellement synthétisées, une fois déposées dans le nucléosome (Song et al., 2008). Ceci est en contraste avec les prédictions de ses fonctions dans le complexe histone acétyltransférase de levure (HAT), vu son degré

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de conservation élevé avec l’histone chaperonne de levure Hat2b. Cependant, des études ultérieures ont montré que p48 seule n’a pas d’activité enzymatique (Verreault et al., 1996).

Seule une petite fraction de p48 cellulaire est associée à CAF-1, la majorité des protéines étant présentes dans d’autres grands complexes (Marheineke and Krude, 1998). P48 est ainsi également présente dans un complexe avec les deux formes variantes de H3, H3.1 et H3.3, ce qui suggère qu’elle joue des rôles supplémentaires en dehors de l’activité de chaperonne d’histone médiée par CAF-1 (Tagami et al., 2004). Ces rôles comprennent le fonctionnement au sein du complexe PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2). Dans les cellules humaines, l'interaction entre p48 et PRC2 joue un rôle dans la limitation de la déposition de la marque d’histone H3K27me3, ce qui permet à certaines régions du génome de rester actives (Vizan et al., 2015). En plus du complexe répresseur Polycomb, p48 a également été identifiée comme jouant un rôle crucial dans le complexe de remodelage/déacétylation NuRD et le complexe de remodelage NURF (Kuzmichev et al., 2002; Martinez-Balbas et al., 1998; Zhang et al., 1999). Des mutations dans l’homologue CHAF1a humain chez S. cerevisiae, la protéine Cac1, réduisent l’interaction avec Cac3p (homologue de p48 humaine) et conduisent à des défauts dans le silencing télomérique (Krawitz et al., 2002).

4.3.3 La sous-unité CHAF1b

CHAF1b se compose de 7 répétitions WD, suivies par une région B-like et un domaine PEST. Bien que les répétitions WD de CHAF1b ont été considérées fournir l'échafaudage nécessaire pour faciliter une interaction directe entre la chaperonne H3/H4 et ASF1a/b et de promouvoir son activité de chaperonne d'histones, des expériences de délétion des résidus N-terminaux 1-418 de CHAF1b ont révélé que ce domaine n'est pas nécessaire pour la liaison à ASF1a/b (Tang et al., 2006). Au contraire, il a été déterminé que l'extrémité C-terminale permet une liaison directe avec ASF1a. La région C-terminale de CHAF1b contient un domaine B-like, d'abord identifié dans p105, l'homologue CHAF1b chez la drosophile, et cette région B-like est nécessaire et suffisante pour la liaison de CHAF1b à ASF1 (Tyler et al., 2001). CHAF1b partage également une homologie de sa région B avec HIRA, une chaperonne de histone H3 indépendante de la réplication qui est activée en premier lieu en dehors de la phase S et a une préférence pour la variante H3.3 (Loppin et al., 2005; Rai and Adams, 2012). Notamment la liaison de ASF1a avec HIRA ou avec CHAF1b est mutuellement exclusive, ce qui suggère que l'expression HIRA peut être une méthode indirecte de régulation de l'activité de CHAF1b (Tagami et al., 2004). En outre, ASF1 est l'une des deux chaperonnes d'histones connues pour avoir en même temps des fonctions

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dépendantes et indépendantes de la réplication, vu ses interactions avec CHAF1b et HIRA (Tagami et al., 2004). Enfin, en plus des répétitions WD à l'extrémité N-terminale et le domaine B-like de l'extrémité C-terminale, CHAF1b possède également un domaine PEST à son extrémité C-terminale (Kaufman et al., 1995). L'activité de ce domaine PEST est en outre soutenue par la constatation que l'élimination de CHAF1a par shRNA conduit à la dégradation ultérieure et rapide de CHAF1b (Ye et al., 2003).

Alors qu'une stœchiométrie stricte 1:1:1 des composants CAF-1 (CHAF1a, CHAF1b et p48) a été initialement proposé (Krude and Knippers, 1993), il a été ultérieurement retrouvé que la perte de la sous-unité p48 peut provoquer des défauts dans la capacité de CAF-1 à chaperonner la chromatine au niveau de la fourche de réplication (Marheineke and Krude, 1998; Tagami et al., 2004; Verreault et al., 1996). Cependant, ce sont des effets secondaires dus à la perte de CHAF1a ou CHAF1b, qui rend le complexe CAF-1 non-fonctionnel (Lee et al., 2009; Nakano et al., 2011). La perte des sous-unités CHAF1a ou CHAF1b conduit à une perte complète de la fonction de CAF-1, pour deux raisons. Tout d'abord, la perte de CHAF1b rend CHAF1a instable à cause de l'exposition et de l'activation subséquente du domaine C-terminal PEST (Ye et al., 2003). Deuxièmement, CHAF1b interagit directement avec ASF1a/b, la chaperonne H3/H4 responsable du maintien du contact direct avec les hétérodimères H3/H4 (Tang et al., 2006). Par conséquent, pendant la phase S, CHAF1b/ASF1a/H3/H4 sont dans un complexe avec CHAF1a, qui à son tour est en contact avec PCNA au niveau de la fourche de réplication. Ce réseau d'interaction permet au complexe CAF-1 de fournir à l'ADN des dimères H3/H4 après le passage de la fourche de réplication.

CHAF1b est également nécessaire pour la synthèse d’ADN par le mécanisme de réparation NER des lésions de l’ADN (De Koning et al., 2007). Après irradiation, CHAF1b est phosphorylée, en une quantité qui est directement liée à l'intensité des dommages induites par des UV (Gaillard et al., 1996). Cette phosphorylation conduit CHAF1b à former des complexes avec CHAF1a et PCNA, qui ensuite se localisent aux sites de lésions de l'ADN (Martini et al., 1998). L'interaction CHAF1b-ASF1a, qui est indépendante de la phosphorylation de CHAF1b (Mello et al., 2002), est responsable de l’incorporation de H3.1 dans les nucléosomes pendant la réparation NER. Cette capacité à fonctionner indépendamment de son état de phosphorylation est critique pour le rôle de CHAF1b dans le mécanisme NER (Volk and Crispino, 2015). CHAF1b est nécessaire aussi pour le recrutement de l’histone H2A ubiquitinylée (H2Au) aux sites de l'ADN endommagés par les UV (Zhu et al., 2009). Cependant, ces observations peuvent résulter de la perte d'un

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complexe CAF-1 intact, réduisant ainsi globalement le dépôt des H3/H4 aux sites des lésions de l'ADN, et en réduisant ensuite le recrutement de H2A (Volk and Crispino, 2015).

Enfin, CHAF1b est le chaperon primaire d'un groupe de protéines d'histone, appelées protamines, qui sont de petites protéines de liaison riches en arginine fortement basiques qui partagent un degré élevé d'homologie avec la protéine histone de liaison H1 (Braun, 2001). Les protamines permettent un très haut degré de compaction de la chromatine, protégeant fonctionnellement l'ADN des spermatozoïdes des dommages physiques et de mutagenèse (Caldwell and Handel, 1991). En effet, les protamines sont capables de condenser l'ADN à une taille qui est près de 200 fois plus petite que dans son état initial, ce qui permet à la moitié du génome de tenir à l'intérieur d'une spermatide. Chez les mammifères, les protamines ne remplacent pas directement les histones, mais fonctionnent par interaction avec des protéines intermédiaires appelées protéines de transition 1 et 2 (TNP1 et TNP2) (Caldwell and Handel, 1991). Une nouvelle fonction de chaperonne histone-indépendante de CHAF1b a récemment été élucidé dans des testicules chez la drosophile: l'homologue de CHAF1b, le facteur p75 est requis pour le dépôt de protamines sur l'ADN au cours de la phase tardive de la spermatogenèse (Doyen et al., 2013). Ces protamines remplacent complètement les histones traditionnelles dans le sperme mature (Eirin-Lopez et al., 2006). Alors que l’homologue de CHAF1a chez la drosophile, le facteur p180 est responsable du ciblage des protamines sur la chromatine des spermatides, l’homologue de CHAF1b, le facteur p75 est responsable de leur dépôt sur l'ADN (Doyen et al., 2013).

4.4 Le complexe FACT : chaperonne des complexes histones