diferenciadas in vitro da cepa Choachí de T. rangeli por eletroforese 2DE
Grande parte dos estudos relacionados à investigação de processos biológicos necessita do suporte de metodologias específicas para a obtenção das diferentes formas evolutivas do parasito. Durante o seu ciclo evolutivo, o T. rangeli alterna entre dois tipos morfológicos principais, epimastigota e tripomastigota, com propriedades características, destacando-se a infectividade para o hospedeiro vertebrado. Neste sentido, várias peculiaridades estão intimamente ligadas ao processo de diferenciação de uma forma para a outra. Uma etapa crucial do ciclo de vida do T. rangeli é o processo de diferenciação celular, durante o qual mudanças coordenadas no metabolismo e na morfologia ocorrem para efetuar uma transformação onde formas não- infectantes e replicativas, os epimastigotas, diferenciam-se em formas infectantes e incapazes de se multiplicar, os tripomastigotas. Nesse sentido, avanços significativos foram alcançados na tentativa de simular as condições naturais que podem levar o parasita a se diferenciar, possibilitando o estudo da reprogramação gênica a que estes organismos são submetidos durante o processo de diferenciação, sobretudo para as formas infectantes (STOCO, 2010). Uma etapa essencial foi o estabelecimento de um meio com condições quimicamente definidas que mimetizam o processo de diferenciação que ocorre no inseto vetor (KOERICH et al., 2002, STOCO, 2010).
A diferenciação de epimastigotas a tripomastigotas metacíclicos envolve alterações físico-químicas que permitem a ocorrência da reprogramação celular que visualmente pode ser acompanhada a partir da análise de modificações morfológicas que podemos visualizar na Figura 6. O cinetoplasto, na forma epimastigota (T0), está presente na porção anterior ao núcleo. Conforme o processo de diferenciação celular
in vitro ocorre, o cinetoplasto migra até a porção posterior do núcleo
caracterizando as formas tripomastigotas. Podemos observar também a membrana ondulante em toda extensão lateral da forma tripomastigota (T8).
Para o T. cruzi é bem estabelecido que o meio de urina artificial de triatomíneos (TAU) e a sua suplementação com prolina induz altas taxas de diferenciação celular de T. cruzi in vitro (CONTRERAS et al., 1985). Entretanto, o T. rangeli não é capaz de diferenciar e nem mesmo
de replicar neste meio. A sua capacidade de crescimento e diferenciação em meio DMEM em pH 8 suplementado com L-glutamina sugere que este aminoácido, assim como as condições de pH estão envolvidas neste processo, e que o T. rangeli, diferentemente do T. cruzi, requer um meio mais rico nutricionalmente para a sua diferenciação em formas tripomastigotas (KOERICH et al., 2002).
Após a obtenção das amostras, foi realizada a extração das proteínas totais das amostras (T0, T2, T4, T6, T8) ao longo do processo de diferenciação celular do T. rangeli e realizados ensaios de eletroforese unidimensional (1DE) e bidimensional (2DE) (Figura 7) com o objetivo de analisar o rol de proteínas diferencialmente expressas durante a transição entre a forma epimastigota (proliferativa e não- infectiva) e a forma tripomastigota (não proliferativa e infectiva). As alterações morfológicas nos parasitos também foram acompanhadas microscopicamente através de esfregaços em lâminas corados com Giemsa.
Para a obtenção dos mapas 2DE foram utilizadas proteínas solúveis de triplicatas biológicas e técnicas das amostras T0, T2, T4, T6, T8 contendo cerca de 0 %, 3,5 %, 57 %, 74 %, 97 % de tripomastigotas, respectivamente. Observa-se um aumento considerável de formas tripomastigotas do segundo dia de diferenciação celular (T2) para o quarto dia (T4), o que pode estar implicado em uma alteração no padrão de expressão proteica com o intuito de preparar ou até mesmo adaptar estes parasitas para a próxima fase do ciclo biológico.
Figura 6: Processo de diferenciação celular in vitro da cepa Choachí de Trypanosoma rangeli em meio DMEM (5% SFB),
evidenciando alterações morfológicas dos parasitos em esfregaços corados com Giemsa. As barras em branco representam 10 µm. N = núcleo e C = cinetoplasto.
Na Figura 7 estão apresentados 10 perfis 2DE obtidos a partir de duplicatas biológicas. Estes perfis foram obtidos a partir de 2 mg de proteínas solúveis resolvidas em tiras de 13 cm, com faixa de pI 3-10 e massa molecular relativa (Mr) entre 10-250 kDa. Pode-se observar que a grande maioria dos spots estão localizados entre a faixa de pI 4-8 e massa molecular relativa 25-75 kDa. Além disso, levando em consideração as variações intrínsecas descritas para a eletroforese 2DE, observa-se uma boa reprodutibilidade dos perfis.
Foram coletados 926 spots das cinco amostras da cultura 1 (1ª replicata biológica), sendo que 918 foram analisados por espectrometria de massas (LC-ESI MS/MS). Para 56,8 % dos spots analisados, foi possível identificar uma ou mais proteínas. Entretanto, inúmeros spots apresentam a mesma proteína identificada resultantes de pequenas variações de massa e carga que podem estar relacionadas a presença de isoformas ou ainda a modificações pós-traducionais. Da cultura 2 (2ª replicata biológica) foram coletados 1.036 spots sendo analisados 139. A análise de apenas 13,4 % dos spots foi em decorrência da impossibilidade de processamento e análise por espectrometria de massas do grande volume de amostras (1.962 para as duas replicatas biológicas descritas neste manuscrito). Desta forma, foram analisadas 1.057 spots (53,8 %) no somatório das duplicatas biológicas, permitindo a identificação de um total de 182 proteínas não-redundantes (Tabelas 3 e 4).
Na Figura 8 está apresentado um gel representativo de todos os géis gerados por 2DE e demarcadas parte das proteínas identificadas por espectrometria de massas e na Tabela 4 estão relatadas as proteínas identificadas.
Figura 7: Eletroforese de extratos proteicos totais durante a diferenciação celular da cepa Choachí de Trypanosoma rangeli.
(A) Perfil unidimensional das amostras nos tempos T0 ,T2, T4, T6 e T8 de duas amostras biológicas (cultura 1 (30 ug) e 2 (50ug)). (B) Perfil bidimensional de extratos proteicos totais de T. rangeli nos tempos T0, T2, T4, T6, T8. Alíquotas de 2 mg de proteínas foram aplicadas em tiras de 13 cm (pH 3-10). Os géis foram corados com Coomassie Brilliant Blue R-250.
Tabela 3: Resumo da quantidade de spots analisados em cada dia do processo de diferenciação celular in vitro da cepa
Choachí de Trypanosoma rangeli.
Amostra biológica 1 Amostra biológica 2 Total
Número de Spots coletados
Spots
analisados Spotscom MS/MS
Número de
Spots
coletados
Spots
analisados Spotscom MS/MS
Número de
Spots
coletados
Spots
analisados SpotsMS/MS com Proteínas não- redundantes T0 (Epi) 232 (96,5 %) 224 (41,9 %) 94 303 (10,2 %) 31 (90,3%) 28 535 (47,6%) 255 (47,8%) 122 87 T2 (2°°°° dia) 124 (100%) 124 (58 %) 72 270 (8,8 %) 24 (100%) 24 394 (37,5%) 148 (64,8%) 96 67 T4 (4°°°° dia) 185 185 (100%) (56 %) 102% 169 (16,5 %) 28 (89,2%) 25 354 (60,1%) 213 (59,6%) 127 83 T6 (6°°°° dia) 169 (100%) 169 (52,7 %) 114 138 (17,4%) 24 (79,1%) 19 307 (62,8%) 193 (68,9%) 133 96 T8 (Tripo) 216 (100%) 216 (53%) 140 156 (49,9%) 32 (87,5%) 28 372 (66,6%) 248 (67,7%) 168 121 Total 926 918 (99,1 %) (56,8%) 522 1036 (13,4%) 139 (89%) 124 1962 (53,8%) 1057 (61,1%) 646 182
Figura 8: (A) Perfil bidimensional do extrato proteico total de formas epimastigotas de Trypanosoma rangeli (primeira replicata biológica); (B) no detalhe, as proteínas identificadas por espectrometria de massas (111 das 167 proteínas comuns a todos os dias do processo de diferenciação celular). Tabela 4: Proteínas não-redundantes identificadas por espectrometria de massas presente nos spots obtidos a partir da técnica de eletroforese bidimensional do extrato proteico total de Trypanosoma rangeli cepa Choachí.
Proteínas Código
de acesso molecular Massa
1 14-3-3 protein TR00226 30 kDa
2 14-3-3 protein TR02934 29 kDa
3 25 kDa translation elongation factor 1-beta TR03422 21 kDa 4 26S proteasome regulatory subunit T5 TR06658 42 kDa 5 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A
ligase TR05897 44 kDa
6 2-oxoisovalerate dehydrogenase alpha
subunit TR05730 49 kDa
7 2-oxoisovalerate dehydrogenase beta
subunit, mitochondrial precursor TR04750 40 kDa
8 40S ribosomal protein S3 TR05151 27 kDa
9 60S acidic ribosomal protein P0 TR03071 35 kDa 10 69 kDa paraflagellar rod protein TR02042 44 kDa
de acesso molecular 11 69 kDa paraflagellar rod protein TR04024 63 kDa
12 actin beta/gamma 1 TR01023 42 kDa