Considerando-se apenas os contigs com a ocorrência de mais de 4 ESTs, foi possível identificar 92 e 117 contigs provenientes das bibliotecas SH2 e SH3, respectivamente. Esse resultado indica que a maior parte dos contigs das
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bibliotecas SH2 e SH3, são formados com poucos (1-4) ESTs dessas bibliotecas. Isto pode ser verificado também, analisando-se a distribuição dos ESTs nos clusters conforme apresentado na figura 4. Deste total de 209 contigs, com mais de 4 ESTs das bibliotecas SH2 e SH3, verifica-se que 26 são comuns e ocorrem nas duas bibliotecas (SH2 e SH3) e 183 são exclusivos e apresentam somente ESTs de SH2 ou SH3. A figura 5 apresenta a expressão relativa desses 26 contigs nas bibliotecas SH2 e SH3 e a tabela 3, apresenta o melhor resultado de BLASTX, correspondente, para cada um desses 26 contigs. Pode-se observar nesta lista a ocorrência de genes já caracterizados como envolvidos na resposta ao estresse hídrico em outras espécies vegetais, como por exemplo, a catalase (contig 9073) e a proteína CDSP32 (contig 18601), entre outros.
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FIGURA 5 Dados de expressão relativa ao cluster mais expresso de cada biblioteca, para os 26 clusters comuns às bibliotecas SH2 e SH3.
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TABELA 3 Resultados de BLASTX dos 26 clusters comuns às bibliotecas SH2 e SH3, com expressão in silico maior que 4 ESTs.
Contig Melhor Blast Hit
Contig93 gb| AAQ56195.1| aminotransferase 2 [Cucumis melo]
Contig936 gb| ABA86964.1| glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase B subunit [Glycine max]
Contig1671 No Hit
Contig4887 emb| CAA66667.1| polyubiquitin [Pinus sylvestris]
Contig4917 gb| AAY89374.1| beta-amylase 1 [Nicotiana langsdorffii x Nicotiana sanderae] Contig5167 gb| AAD27877.1| LHCII type III chlorophyll a/ b binding protein [Vigna radiata] Contig5701 gb| ABG73417.1| chloroplast pigment-binding protein CP26 [Nicotiana tabacum] Contig6546 emb| CAA62364.1| L1 protein [Arabidopsis thaliana]
Contig9073 emb| CAA85426.1| catalase [Nicotiana plumbaginifolia]
Contig9576 dbj| BAD45891.1| polyubiquitin [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] Contig10102 gb| AAA34140.1| chlorophyll a/ b-binding protein
Contig10248 gb| AAA18529.1| chlorophyll A/ B binding protein Contig10308 gb| AAM22683.1| carbonic anhydrase [Gossypium hirsutum]
Contig10486 gb| ABC59515.1| chloroplast photosystem II 22 kDa component [Nicotiana benthamiana] Contig11086 dbj| BAA03131.1| glycolate oxidase [Cucurbita cv. Kurokawa Amakuri]
Contig11711 emb| CAB16918.1| P-Protein precursor [Solanum tuberosum] Contig14431 emb| CAA36380.1| unnamed protein product [Gossypium hirsutum]
Contig14893 gb| ABE83482.1| AAA ATPase, central region; Homeodomain-like [Medicago truncatula] Contig15009 emb| CAB51533.1| galactinol synthase, isoform GolS-1 [Ajuga reptans]
Contig15049 gb| ABE93728.1| Ferric reductase-like transmembrane component [Medicago truncatula] Contig15182 ref| NP_179721.1| oxidoreductase [Arabidopsis thaliana]
Contig15278 gb| ABA96025.1| flavin-containing monooxygenase, putative [Oryza sativa (japonicacultivar-group)] Contig15873 ref| NP_567574.1| ATP binding / kinase/ protein serine/ threoninekinase/ protein-tyrosine kinase [A.thaliana] Contig17834 gb| ABE83482.1| AAA ATPase, central region; Homeodomain-like [Medicago truncatula]
Contig17954 sp| P09043| G3PA_TOBAC Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A, chloroplast precursor Contig18601 emb| CAA71103.1| CDSP32 protein (Chloroplast Drought-induced Stress Protein of 32kDa) [S.tuberosum]
Já a figura 6, apresenta a expressão relativa in silico dos 20 contigs mais expressos das bibliotecas SH2 e SH3. O melhor resultado de BLASTX correspondente a cada um desses contigs está listado na tabela 4. Analisando-se os dados apresentados na figura 6 pode-se observar que o contig 10659 é o que apresenta maior expressão in silico, nesta biblioteca. O resultado de BLASTX para esse contig (tabela 4) indica similaridade com a rubisco, resultado esperado, uma vez que a biblioteca SH2 foi construída a partir de RNA total extraído de folhas, predominantemente. Já no caso da biblioteca SH3, o contig com maior expressão in silico, contig 15182, apresenta similaridade com a uma putativa NADPH dependent mannose 6-phosphate reductase, sendo o contig com
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similaridade com a rubisco o 3° mais expresso, nesta biblioteca. Este dado pode ter significado biológico, uma vez que a biblioteca SH3 foi construída a partir de material vegetal de um clone de conillon, previamente caracterizado como tolerante à seca. Além disto, os dados de expressão in silico, na biblioteca SH2 (3° mais expresso) é mais um indicativo de que o contig 15182 pode estar envolvido na resposta ao estresse hídrico em café. Por último, a diferença dos contigs com similaridade à rubisco, pode ser também explicado pela diferença dos materiais genéticos utilizados para a contrução das bibliotecas.
Além do contig 15182, mencionado acima, 4 outros aparecem na lista dos 20 genes mais expressos, tanto nas bibliotecas de SH2 e SH3 e são potenciais candidatos para o envolvimento na resposta ao estresse hídrico em cafeeiro (figura 6). A presença de um contig com similaridade a uma catalase (contig 9073), nesta lista, corrobora com o potencial envolvimento desses genes na proteção ao mecanismo oxidativo causado pelo estresse hídrico.
31 0 20 40 60 80 100 Contig15182 Contig18205 Contig13239 Contig9850 Contig9174 Contig10248 Contig9073 Contig18219 Contig17817 Contig10486 Contig15009 Contig2617 Contig1671 Contig18335 Contig14893 Contig93 Contig18250 Contig18452 Contig17836 Contig14431 123 456789 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 SH3 SH3
FIGURA 6 Dados de expressão relativa ao cluster mais expresso de cada biblioteca, para os 20 clusters com maior expressão in silico das bibliotecas SH2 e SH3. As esferas ilustram os clusters comuns às duas bibliotecas.
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TABELA 4 Resultados de BLASTX dos 20 clusters com maior expressão in
silico nas bibliotecas SH2 (painel superior) e SH3 (painel inferior).
As setas apontam os clusters comuns às duas bibliotecas (SH2 e SH3).
SH2
Contig Melhor Blast Hit
Contig50 gb| AAB31705.1| photosystem I subunit PSI-E [Nicotiana sylvestris] Contig1561 gb| ABE87096.1| Glycoside hydrolase, family 18 [Medicago truncatula]
Contig1671 No Hit
Contig7501 gb| AAL01886.1| chitinase 3-like protein precursor [Trichosanthes kirilowii] Contig7528 gb| ABE79940.1| Aldo/ keto reductase [Medicago truncatula]
Contig8971 gb| AAL01886.1| chitinase 3-like protein precursor [Trichosanthes kirilowii] Contig9073 emb| CAA85426.1| catalase [Nicotiana plumbaginifolia]
Contig9189 No Hit
Contig9333 gb| ABE83482.1| AAA ATPase, central region; Homeodomain-like [Medicago truncatula] Contig9409 dbj| BAA89317.1| 23kDa polypep. oxygen-evolving complex of photosystem II [C. sativus] Contig9985 gb| ABB29942.1| S-adenosyl methionine synthase-like [Solanum tuberosum]
Contig10569 emb| CAD11991.1| rubisco small subunit [Coffea arabica] Contig14431 emb| CAA36380.1| unnamed protein product [Gossypium hirsutum] Contig14032 gb| AAO33591.1| putative early light induced protein [Arachis hypogaea] Contig14066 ref| NP_199832.1| quinolinate synthetase A [Arabidopsis thaliana] Contig14592 gb| AAL01886.1| chitinase 3-like protein precursor [Trichosanthes kirilowii]
Contig14893 gb| ABE83482.1| AAA ATPase, central region; Homeodomain-like [Medicago truncatula] Contig15182 ref| NP_179721.1| oxidoreductase [Arabidopsis thaliana]
Contig17834 gb| ABE83482.1| AAA ATPase, central region; Homeodomain-like [Medicago truncatula] Contig17964 ref| NP_179721.1| oxidoreductase [Arabidopsis thaliana]
SH3
Contig Melhor Blast Hit
Contig93 gb| AAQ56195.1| aminotransferase 2 [Cucumis melo]
Contig1671 No Hit
Contig2617 ref| NP_179721.1| oxidoreductase [Arabidopsis thaliana] Contig9073 emb| CAA85426.1| catalase [Nicotiana plumbaginifolia]
Contig9174 emb| CAE05952.3| OSJNBb0088C09.11 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] Contig9850 emb| CAA88629.1| pre-pro-cysteine proteinase [Lycopersicon esculentum] Contig10248 gb| AAA18529.1| chlorophyll A/ B binding protein
Contig10486 gb| ABC59515.1| chloroplast photosystem II 22 kDa component [Nicotiana benthamiana] Contig13239 emb| CAD11991.1| rubisco small subunit [Coffea arabica]
Contig14431 emb| CAA36380.1| unnamed protein product [Gossypium hirsutum]
Contig14893 gb| ABE83482.1| AAA ATPase, central region; Homeodomain-like [Medicago truncatula] Contig15009 emb| CAB51533.1| galactinol synthase, isoform GolS-1 [Ajuga reptans]
Contig15182 ref| NP_179721.1| oxidoreductase [Arabidopsis thaliana]
Contig17817 gb| AAO33591.1| putative early light induced protein [Arachis hypogaea] Contig17836 gb| AAO33591.1| putative early light induced protein [Arachis hypogaea]
Contig18205 No Hit
Contig18219 No Hit
Contig18250 No Hit
Contig18335 No Hit
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5.4 Análise dos resultados de BLASTX dos clusters formados