LacZ, Col LacZ Col LacZ, Col RFP ȕ-3tub RFP,ȕ-3tub EcolCRMLacZ EcolCRMH2bRFP
(http://flybase.org/reports/FBgn0207606.html). J’ai donc généré des constructions plaçant LacZi sous le contrôle des Ecol-CRM et Lcol-CRM. J’ai vérifié que l’intron ȕtubulin56D est correctement épissé chez D. melanogaster en m’assurant que les patrons d’accumulation de la protéine LacZ sont identiques en présence ou absence de cet intron. Des doubles hybridations in situ, avec des sondes col et lacZ, sur les embryons Ecol-CRMlacZi ou Lcol- CRMlacZi m’ont ensuite permis de déterminer que le Ecol-CRM est actif dans le groupe promusculaire à l’origine du PC DA3/DO5 et que le Lcol-CRM est activé dans le PC DA3/DO5 et reste actif pendant la différenciation du muscle DA3. De manière intéressante, la période de recouvrement de l’activité de ces 2 CRM est limitée au PC. Ceci a permis de révéler un mécanisme dit de passage de témoin, l’activité du CRM précoce étant nécessaire à l’activation du CRM tardif. Indépendamment, l’analyse de l’expression du Ecol-CRMlacZi dans la glande lymphatique montre que son expression est exclue du PSC (Post Signaling Center : la niche hématopoïétique) à la fin de l’embryogenèse (Figure 24 D-D’’). Ce résultat suggère que 2 CRM différents sont responsable de l’expression précoce de col dans les cellules précurseur de la glande lymphatique et le PSC.
En conclusion, mes résultats ont montré que le Ecol-CRM intègre une information de position et une information tissulaire permettant son activation dans un groupe promusculaire dans tous les segments. La protéine Col accumulée active le Lcol-CRM dans un des PC issus de ce groupe permettant le maintien de l’expression de Col dans le lignage DA3. Ce mécanisme de passage de témoin met en jeu une autorégulation directe de Col et une coopération des protéines Hox et du FT Nau. La restriction de ce processus à un seul des PC exprimant Col indique que d’autres acteurs, responsable de cette spécifié, restent à identifier.
B. Analyse du destin des FCM issus du groupe promusculaire Col
La caractérisation du Ecol-CRM ma permis d’aborder une question restée en suspens depuis longtemps : les FCM issus d’un même groupe promusculaire sont ils réellement naïfs ou, au contraire programmés pour contribuer à la formation d’un sous ensemble spécifique de muscles ?
Afin de répondre à cette question, j’ai commencé par utiliser les lignées Ecol-CRM-LacZ et exploiter la stabilité de la protéine LacZ pour suivre le destin des FCM issus du groupe promusculaire Col dans les embryons tardifs (Figure 25 A-B’’). Mes premières observations ont montré que ces FCM contribuent principalement aux muscles dorsaux-latéraux (Figure 25 B-B’’). Cependant, d’une manière surprenante, un double immuno-marquage Col/LacZ montre que le muscle DA3, le plus dorsal des muscles dorso-latéraux, est peu positif pour LacZ (Figure 25 B-B’’), suggérant que les FCM incorporés dans la fibre DA3 pourraient être
col1, Ecol-CRMH2b-RFP Ecol-CRMH2b-RFP ȕ-3tub RFP ȕ-3tub RFP
A
A’
A’’
B
B’
B’’
Figure 26. Impact de l’expression de col sur le devenirs des FCM. Double immunomarquage RFP et ȕ3-tubulin sur des embryons EcolCRMH2bRFP (A-A’’) et col1;
EcolCRMH2bRFP (B-B’) au stade 16. Contrairement au contrôle (A-A’’), dans un mutant col1
d’origine dorsale au groupe promusculaire Col. Afin de compléter cette analyse, j’ai exprimé une protéine de fusion Histone2b-RFP sous le contrôle du Ecol-CRM (Figure 25 C-C’’). L’expression transitoire de l’Histone2b-RFP permet de marquer spécifiquement et sélectivement les noyaux des cellules du groupe promusculaire Col et de les suivre dans des embryons tardifs. Une double immuno-coloration RFP et ȕ3-Tubulin (marqueur musculaire) a confirmé que les FCM du groupe promusculaire Col contribuent principalement à la formation des muscles dorso-latéraux, mais peu au muscle DA3 (Figure 25 C-C’’). Ces FCM participent également à la formation du muscle SBM qui est un muscle latéral dérivant d’un progéniteur qui n’est pas issu du groupe promusculaire Col (Figure 25 D). L’ensemble de ces résultats suggèrent que plutôt qu’une information identitaire conférée par l’expression transitoire de Col, la répartition des FCM reflète leur position initiale dans le mésoderme. Afin d’étayer ou réfuter cette hypothèse, nous avons répété l’expérience dans des embryons mutants pour col. Le transgène rapporteur Ecol-CRMH2B-RFP a été introduit dans le mutant nul col1, (col1 ; Ecol-CRMH2b-RFP), dans lequel les muscles dorso-latéraux sont généralement présents mais présentent des défauts morphologiques (Enriquez et al., 2012) (Figure 26 A’-B’). Un double marquage RFP/ȕ3-tubulin montre une plus grande dispersion des FCM du groupe promusculaire Col qui sont maintenant détectés dans des muscles plus ventraux et dorsaux (Figure 26 A’’-B’’). Une interprétation possible est que l’expression transitoire de Col restreint la dispersion des FCM, ce qui serait la première indication que les FCM ne sont pas strictement naïfs. Cependant, ces expériences méritent d’être répétées avec l’analyse d’autres marqueurs et dans d’autres contextes mutants (e.g., tup).
L’observation d’un faible marquage du muscle DA3 dans les expériences de lignage Ecol- CRM-LacZ (Figure 25 B-B’) nous a incités à examiner en plus de détail la répartition des noyaux lacZ+ et LacZ- dans ce muscle. Pour cela, j’ai généré un transgène permettant de visualiser les contours cellulaires du muscle DA3. Ce transgène, LcolCRMMoeGFP, place une GFP membranaire (Moesin-GFP) sous le contrôle du Lcol-CRM (Figure 27 A-A’). Un triple marquage GFP, RFP et Mef2 (pour visualiser les noyaux de tous les myoblastes) d’embryons LcolCRMMoeGFP ; Ecol-CRMH2B-RFP permet de voir quels noyaux (Mef2) au sein du muscle DA3 (GFP-positif) sont issus du groupe promusculaire Col (RFP-positif) ou d’un autre groupe promusculaire (RFP-négatif) (Figure 27 B-B’). Les résultats indiquent qu’environ la moitié des noyaux du muscle DA3 est RFP-positive (Figure 27 B-B’ et D). La même expérience a été réalisée pour le muscle dorso-latéral DT1 dont le PC est aussi issu du groupe promusculaire Col. Dans ce cas, nous avons utilisé un transgène rapporteur S59- GFP (Figure 27 C-C’). A nouveau, une moitié environ des noyaux du muscle DT1 sont marqué par la RFP (Figure 4 C-C’ et D). Ces données, générées en collaboration avec Laëtitia Bataillé, nous conduisent à conclure que les FCM incorporés dans les muscles ne