La technique de BACTH (Bacterial Adenylate Cyclase Two Hybrid)

Cette technique de Double Hybride est basée sur la complémentation fonctionnelle chez

E. coli de fragments de l’adénylate cyclase de Bordetella pertussis, CyaA (Karimova et al.,

1998). Elle exploite le fait que l’adénylate cyclase de B. pertussis soit clivable par protéolyse en deux fragments complémentaires, T25 et T18 (figure 50A et B) (Karimova et al., 1998; pour revue, voir Ladant & Ullmann 1999). La réassociation de ces deux fragments reconstitue une protéine active. En conditions standard, cette association est assurée par la Calmoduline qui forme un complexe ternaire avec les deux fragments. La technique de BACTH repose sur

Figure 51. Exemples de croisement entre les protéines RcsA et RcsB entières. A. Test d’interaction sur milieu LA-XGal-IPTG. Trois clones de chaque double transformation ont été étalés en patch. Seules les interactions pKT25RcsA x pUT18CRcsB (AxB) et pKT25RcsB x pUT18CRcsB (BxB) sont montrées ici. Témoin positif (T+), pKT15zip x pUT18Czip (avec zip = leucine zipper de GCN4); témoin négatif (T-), pKT25 x pUT18C. B. Test d’interaction sur milieu LA-XGal IPTG avec étalement en spots de dilutions décimales. C. Dosage β-galactosidase sur les croisements obtenus. Les activités des croisements pUT18CRcsA x pKT25RcsB et RcsB x RcsB sont identiques à celle du témoin négatif (~170 U.M, contre 8000 U.M pour le témoin positif).

1 10 100 1000 10000 R csB x R csB (143x 149) R csA x R csB (24x 149) pU T 18C x pK T 2 5 pU T 18C z ip x pK T 25z ip U. M T+ T- BxB AxB T+ T- BxB AxB RcsBxRcsB RcsBxRcsA RcsAxRcsB pKT25xPUT18C zip x zip RcsBxRcsB RcsBxRcsA RcsAxRcsB pKT25xPUT18C zip x zip A. B. C.

Figure 52. Croisement des sous-domaines des protéines Rcs. Seuls les croisements les plus

pertinents (en accord avec les données de la littérature) ont été effectués. Exemple d’étalement en patch sur milieu LA-XGal IPTG des croisements pKT25-RcsBD2 x pUT18C-

RcsDHPt et pKT25RcsDHPt x pUT18C-RcsBD2.

T+, témoin positif (pKT25zip x pUT18Czip); T-, témoin négatif (pKT25 x pUT18C).

cette nécessité d’association pour détecter d’éventuelles interactions entre deux protéines. En effet, chez E. coli (qui ne possède pas de Calmoduline ou autre protéine associée), dans une souche déficiente pour l’adénylate cyclase (cya-) les fragments T25 et T18 fusionnés à des protéines (X et Y) ne peuvent restaurer la synthèse d’AMPc que si ces protéines sont capables d’interagir entre elles (Figure 49C). L’AMPc ainsi produit se fixe alors à la protéine CAP

(Catabolite Activator Protein), formant un complexe capable de réguler de nombreux gènes (Ulmann & Danchin 1983). Il permet notamment l’activation des gènes des opérons lac et mal impliqués dans le catabolisme du lactose et du maltose, respectivement (figure 50D). La bactérie redevient ainsi capable d’utiliser l’un ou l’autre de ces sucres comme source de carbone, permettant un crible aisé basé sur l’utilisation, soit d’un milieu sélectif (milieu minimum + maltose par exemple), soit d’un milieu complet permettant un repérage coloré des interactants potentiels (Mac Conkey + maltose ou Luria-Bertani Agar + X-gal).

II. Résultats

Avant de créer une banque pour la recherche des partenaires du système Rcs, nous avons cherché à mettre en évidence les interactions à l’intérieur du système. Pour cela, les gènes ou des fragments de gènes codant pour les protéines entières ou les différents modules du système Rcs (à l’exception de la lipoprotéine de la membrane externe RcsF) ont été fusionnés traductionnellement en aval des fragments T25 (dans pKT25) et T18 (dans pUT18C) de CyaA, et exprimés par le promoteur lacUV5. Toutes les constructions ont été séquencées et

pour certaines la fonctionnalité a été testée par complémentation (voir Matériels et Méthodes). Le test d’interaction est réalisé par la double transformation des dérivés de pKT25/pUT18BC dans une souche cya- d’E. coli. Malgré différentes conditions expérimentales utilisées, aucune interaction protéique au sein du système Rcs n’a pu être mise en évidence même entre partenaires pour lesquels des interactions avaient été rapportés dans la littérature : entre RcsCD1/RcsDHPt et RcsDHPt/RcsBD2 (Rogov et al., 2004; Rogov et al., 2008), RcsA/RcsA et

RcsB/RcsB (Butland et al., 2005) (voir figures 51 et 52).

Nous n’avons pas d’explication satisfaisante quant à ces résultats négatifs. Soit nous n’avons pas su trouver les bonnes conditions pour effectuer le test, soit ce test n’est pas adapté au système Rcs car les interactions sont trop faibles. Dans le cas de RcsB, un des problèmes pouvant expliquer l’absence de résultats est la toxicité des constructions.

Discussion et

perspectives

La complexité du système de transduction du signal RcsCDB/FA pose la question de l’avantage évolutif des phosphorelais His-Asp-His-Asp par rapport aux systèmes à deux composants simples. Tout au long de ce manuscrit, j’ai évoqué les hypothèses suivantes quant au rôle de cette complexité : (i) elle permettrait l’intégration de signaux de nature différente en offrant plusieurs voies d’entrée dans le système Rcs, (ii) elle intégrerait la réponse Rcs à une réponse cellulaire plus globale impliquant d’autres systèmes de régulation. J’ai également mentionné le peu de données disponibles au début de ce travail quant au rôle du phosphorelais Rcs dans l’adaptation des cellules à leur environnement. C’est sur la base de ces hypothèses et dans le but d’élargir nos connaissances sur les rôles de ce système dans la physiologie cellulaire que je me suis principalement intéressée à l’une des originalités du phosphorelais Rcs : le co-facteur RcsA. Mon intérêt pour cette protéine nous a d’abord permis de mettre en évidence, pour la première fois, un rôle de ce système Rcs dans l’adaptation à un stress environnemental pertinent pour E. coli, la résistance à l’acidité (bien que finalement, la participation de RcsA à ce phénomène ne soit pas clairement établie). Dans un deuxième temps, l’étude de l’autorégulation du gène rcsA nous a mené à remettre en question la mécanistique d’action des protéines RcsA et RcsB sur sa transcription, ainsi qu’à une meilleure définition des cibles RcsA-dépendantes et –indépendantes. Enfin et de manière plus globale, une approche par double hybride bactérien devait nous permettre d’identifier le maximum de partenaires protéiques du système, nous fournissant de nouveaux indices quant à ses rôles biologiques. Malheureusement, cette partie de mon travail n’a pas abouti.