La recherche de gènes candidats

Cette partie a pour objectif de présenter les différentes stratégies disponibles pour identifier des gènes

candidats d’après leur localisation génétique et sans a priori sur la fonction physiologique.

a/Matériel végétal

Dans le cas de la recherche de gènes candidats associés à l’effet d’un QTL pour un caractère d’intérêt, le choix du matériel végétal est un facteur déterminant pour optimiser l’efficacité de la démarche. Il faut à la fois disposer de génotypes aux phénotypes contrastés et cibler l’intervalle du QTL. Pour cela, une stratégie envisageable consiste à rechercher des gènes différentiellement exprimés entre la lignée parentale et une lignée quasi-isogénique à l’exception de la région du QTL, afin d’isoler des gènes candidats pour le QTL étudié. Une étape de cartographie est cependant nécessaire pour vérifier que le gène identifié colocalise avec le QTL. Cependant, la sélection de QTL-NIL est une phase longue et lourde qui suppose que l’effet individuel du QTL sur le caractère est stable. Chez la tomate, une

population de lignées d’introgression (IL) issue du croisement interspécifique S. pennellii x S.

esculentum est disponible (Eshed and Zamir, 1994). Elle est constituée de 75 IL découpant le génome en 107 fragments (Annexe 1). Le phénotypage de cette population pour le caractère d’intérêt constitue une approche intéressante pour identifier des génotypes au phénotype contrasté et s’affranchir de l’étape de création de QTL-NIL.

b/Etude du transcriptome

L’étude du transcriptome consiste à établir des profils d’expression des ARN messagers transcrits à un moment donné dans un tissu donné. Ce type d’approche a été initialement appliqué chez les espèces modèles mais s’est démocratisé grâce au développement de collections d’EST et de séquences génomiques, notamment chez la tomate, l’abricot ou la vigne pour les espèces fruitières. Plusieurs méthodes de criblage à haut et moyen débit sont utilisées pour la recherche de gènes candidats par l’étude du transcriptome.

La technique de cDNA-AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) combine l’utilisation

d’enzymes de restriction et l’amplification PCR appliquée à des populations d’ARN messagers pour identifier des gènes différentiellement exprimés. Une étude récente décrit l’utilisation de cette technique pour l’identification de gènes associés à la qualité de la baie de raisin (Tonutti and Bonghi, 2006).

L’utilisation de banques soustractives ou SSH (Suppression Substractive Hybridization) permet d’identifier des gènes différentiellement exprimés, même faiblement représentés, en normalisant la population d’ADNc par amplification PCR et en éliminant par hybridation soustractive les transcrits communs aux deux modalités comparées. Ce type d’approche a été développé chez la tomate pour la caractérisation de la résistance à un virus (Collazo et al., 2005). Concernant le fruit, des études utilisant cette technique ont été réalisées chez la vigne pour la caractérisation d’un mutant aux baies sans chair et pour l’identification de gènes contrôlant la couleur du fruit (Ageorges et al., 2006; Fernandez et al., 2006).

La technique SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) consiste à isoler et séquencer des fragments

d’ADNc en utilisant des étiquettes spécifiques d’un ARN messager afin d’identifier, de façon quantitative, l’ensemble des gènes transcrits dans un tissu. Cependant, cette technique nécessitant une bonne connaissance du génome (en termes de séquences) a surtout été utilisée chez la levure, l’homme et les animaux. Quelques travaux ont été réalisés chez les plantes (Lorenz and Dean, 2005)

notamment chez le riz et A. thaliana, et récemment chez l’orge pour étudier les profils de transcription

du grain au cours du processus de maltage (White et al., 2006).

Enfin, le développement récent, chez plusieurs espèces, de techniques basées sur l’hybridation,

utilisant des puces nucléiques (microarrays), permettent de comparer l’expression de plusieurs

gènes simultanément. On distingue les puces à ADN où des produits PCR issus de clones d’ADNc

sont déposés sur la lame de verre et les puces à oligonucléotides où de petits oligonucléotides

sont synthétisés directement sur la lame de verre.

Chez la tomate, les deux types de filtres haute densité sont disponibles.

- Les puces à ADNc Tom-1 (http://bti.cornell.edu/CGEP/CGEP.html) ont été développées à

partir des clones issus de 27 banques d’EST et sont composées de 12899 clones qui

représentent 8500 gènes indépendants (Alba et al., 2004). Ces puces ont été utilisées chez le

fruit pour identifier les gènes impliqués dans les stades de développement précoces

(Lemaire-Chamley et al., 2005), caractériser les gènes différentiellement exprimés au cours du

développement chez le mutant de la maturation Nr (Alba et al., 2005), rechercher des gènes

candidats pour un QTL contrôlant les variations de teneur en solides solubles (Baxter et al.,

2005), et réaliser une étude comparative des gènes impliqués dans le développement et la

maturation du fruit chez les Solanacées (Moore et al., 2005).

- Les puces à oligonucléotides GeneChip® Tomato Genome Array utilisant la technologie

Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara CA, Etats-Unis) sont composées de 10000 spots représentant au final de 9200 transcrits. L’avantage de cette technologie est que les sondes sont généralement spécifiques de l’isoforme d’un gène, limitant ainsi les hybridations croisées entre gènes de la même famille multigénique. A ce jour, aucun travail utilisant ces lames chez la tomate n’a été publié.

Synthèse bibliographique

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c/Etude du protéome

Le protéome est l’ensemble des protéines exprimées par le génome à un instant donné selon la

définition de Wasinger et al. (1995) "PROTein complement Expressed by a genOME". Généralement,

on parle du protéome d’un tissu, d’une cellule ou d’un organite. L’analyse par électrophorèse sur gels bidimensionnels (E2D) reste la technique la plus répandue pour la séparation des protéines et permet de visualiser les protéines les plus abondantes d’un tissu en les séparant selon leur masse et leur charge. Ensuite, l’analyse par spectrométrie de masse (SM) peut permettre d’identifier la fonction des protéines détectées.

Grâce à l’enrichissement des bases de données de séquences nucléiques suite à différents programmes de séquençage de génomes et au développement de nombreuses banques d’EST, l’identification des protéines a été facilitée ce qui a favorisé l’essor de la protéomique comme outil pour la caractérisation de protéines. Ce type d’approche s’est développé récemment et suscite un intérêt grandissant dans le monde végétal si l’on considère le nombre de revues consacrées à ce

sujet, publiées ces dernières années (Barbier-Brygoo and Joyard, 2004; Cánovas, 2004; Kersten et al.,

2002; Rose et al., 2004; Rossignol, 2001; Thiellement et al., 1999; Zivy and de Vienne, 2000). La caractérisation du protéome est une approche complémentaire de l’étude du transcriptome. En effet, un transcrit peut être à l’origine de plusieurs protéines suite à l’épissage alternatif et la quantité de protéine ne correspond pas forcément à la quantité de transcrit. De plus, les protéines subissent des modifications post-traductionnelles qui peuvent avoir des répercussions sur leur fonction, leur activité ou leur transport (Mann and Jensen, 2003). Enfin, le transcriptome n’apporte pas d’information quand à la localisation cellulaire des protéines qui seront traduites.

Jusqu’à présent, chez les végétaux, la plupart des travaux concernant le protéome était essentiellement descriptifs et consistait à énumérer les protéines présentent dans un tissu ou un

organite à un moment précis (Kieselbach and Schroder, 2003; Mechin et al., 2004; Noir et al., 2005).

Désormais des approches quantitatives sont également développées par la recherche de différentiels d’expression de protéines (protéomique différentielle). Cependant, peu d’études sur le fruit ont été publiées. Ceci s’explique essentiellement par la difficulté d’obtenir des extraits protéiques ce qui a demandé la mise au point de protocoles spécifiques (Faurobert et al., 2006; Saravanan and Rose,

2004). Ceci dit, quelques travaux ont été réalisés sur le mésocarpe du raisin (Sarry et al., 2004) et sur

l’abricot à différents stades de développement (Grimplet et al., 2004). Chez la tomate, quelques études consacrées au protéome du fruit ont été publiées et concernent la comparaison de différentes variétés (Rocco et al., 2006) et l’étude des variations protéiques au cours du de développement du

fruit (Faurobert et al., in press). L’approche protéome en relation avec la caractérisation génétique de

caractères quantitatifs a été décrite pour la première fois chez le maïs où les quantités de protéines ont été utilisées au même titre que des données phénotypiques pour la détection de QTL, renommés

PQL pour Protein Quantity Loci (Damerval et al., 1994). Des travaux concernant la recherche de PQL

(Consoli et al., 2002; de Vienne et al., 1999), le caractère de dureté du grain chez le blé (Amiour et

al., 2003) et l’étude des protéines des aiguilles du pin maritime (Costa and Plomion, 1999).