La quantification par CPG-SM

II.4.3.a. Méthode de l’étalon interne : principe.

La réponse du détecteur par spectrométrie de masse pour une molécule M est proportionnelle à la concentration de la molécule M dans la solution analysée. Cette proportionnalité se traduit par l’équation III.3 :

(Equation III.3) Aire M = K M . C M + constante

Dans cette équation, C est la concentration en mol/L ou g/L et K correspond au facteur de réponse. K et la constante sont fonctions du détecteur, de la molécule et de l’environnement de la molécule, c’est-à-dire les molécules qui entourent la molécule M. Les interactions entre la molécule à analyser et les autres molécules qui l’entourent sont nommées effet de matrice.

Le détecteur peut être calibré de manière à connaître les valeurs de K et de la constante, mais cette calibration n’est valable que pour des solutions présentant des compositions voisines de manière à avoir les mêmes effets de matrice.

L’intérêt de la quantification via la méthode de l’étalon interne est d’éliminer les incertitudes liées aux effets de matrice. Pour cela un standard interne (SI) est ajouté dans la solution à analyser. Le SI est une molécule, qui ne se retrouve pas dans la nature, chimiquement et structurellement proche de la molécule à analyser de manière à ce que ces deux molécules subissent les mêmes effets de matrice. L’équation III.3 peut être appliquée au SI et devient l’équation III.4 :

(Equation III.4) Aire SI = K SI . C SI + constante’ Le rapport de l’équation III.3 sur l’équation III.4 devient l’équation III.5 :

Les deux molécules subissent des effets de matrice proches à identiques. Le facteur K qui représente le rapport des facteurs de réponse n’est plus fonction de l’environnement de la molécule M et du SI mais simplement de la molécule M, du SI et du détecteur. La calibration du détecteur avec des solutions dont les concentrations en molécule M et en SI sont connues permet d’obtenir les constantes K et constante’’ qui serviront à la quantification de la molécule M dans les différentes matrices environnementales analysées.

Les constantes obtenues lors de la calibration ne sont valables que pour une molécule donnée, quantifiée avec un SI donné avec un spectromètre de masse donné fonctionnant sur un mode d’acquisition donné (Fullscan ou SIM). Changer l’un de ces paramètres modifie les constantes, il est donc nécessaire de mener les analyses quantitatives dans les mêmes conditions que les calibrations et de refaire régulièrement les calibrations pour pallier aux changements de paramètres du spectromètre de masse.

II.4.3.b. Molécules pures.

La calibration pour une molécule donnée nécessite d’avoir la molécule pure. Les molécules utilisées au laboratoire sont : 16 hydrocarbures aromatiques polycycliques ou HAP (naphtalène, acénaphtène, acénaphtylène, fluorène, phénanthrène, anthracène, fluoranthène, pyrène, benzo[a]anthracène, chrysène, benzo[b]fluoranthène, benzo[k]fluoranthène, benzo[a]pyrène, indeno[1,2,3-cd]pyrène, dibenzo[a,h]anthracène, benzo[g,h,i]pérylène). 5 molécules aromatiques oxygénées ont été également utilisées (dibenzofurane, fluorénone, périnaphténone, anthraquinone et benzanthrone) ainsi que deux molécules aromatiques azotées (carbazole et acridine). La solution de n-alcanes est composée des hydrocarbures allant du n-C10 au n-C40 sans le n-C39 et contient aussi du pristane et du phytane. Sont aussi utilisés 6 acides n-alcanoïques (n-C12 :0, n-C14:0, n-C16:0, n-C18:0, n-C20:0 et n-C24:0) et deux n -alcanols (n-C22:0 et n-C28:0). Enfin cinq stéroïdes sont également utilisés : l’épicoprostanol (5β-cholestan-3α-ol), le cholestérol (cholest-5-en-3β-ol), le cholestanol (5α-cholestan-3β-ol), le stigmastérol (24β-éthylcholest-5-en-3β-ol) et le stigmastanol (24β-éthyl-5α-cholestan-3β -ol).

II.4.3.c. Mode opératoire pour la calibration.

Trois types de solution de calibration ont été préparés. Le premier type de solution contient les n-alcanes plus le pristane et le phytane ainsi que les quatre n-alcanes perdeutérés en tant que standards internes. Cinq solutions de concentration croissante (0,5 ; 1 ; 2 ; 4 et 8 µg/mL) ont été préparées. Dans ces cinq solutions la concentration en SI est de 4 µg/mL. La calibration est donc valable pour des concentrations en molécule à quantifier comprises entre 0,5 et 8 µg/mL.

Le deuxième type de solution contient les hydrocarbures aromatiques polycycliques, les cétones aromatiques, les azaarènes et le dibenzofurane ainsi que les cinq HAP perdeutérés en tant que SI. Six solutions de concentration croissante (0,5 ; 1 ; 2 ; 4 ; 6 et 8 µg/mL) ont été préparées. Dans ces six solutions la concentration en SI est de 4 µg/mL. La calibration est donc valable pour des concentrations en molécule à quantifier comprises entre 0,5 et 8 µg/mL. Le troisième type de solution contient les acides n-alcanoïques, les n-alcanols et les stéroïdes ainsi que les quatre n-alcanes perdeutérés et le cholestane d6 en tant que SI. Cinq solutions de concentration croissante (0,5 ; 1 ; 2 ; 4 et 6 µg/mL) ont été préparées. Dans ces cinq solutions la concentration en SI est de 4 µg/mL. La calibration est donc valable pour des concentrations en molécule à quantifier comprises entre 0,5 et 6 µg/mL.

Toutes ces solutions sont préparées en utilisant de la verrerie jaugée et du DCM comme solvant. Elles sont ensuite conservées au réfrigérateur à 4°C. Les deux premiers types de solution sont analysés directement en CPG-SM en mode fullscan. Le troisième type de solution comporte des molécules polaires et il est nécessaire de faire une réaction de dérivatisation en utilisant le BSTFA + TMCS en appliquant le mode opératoire décrit au § II.4.1.b.avant de les analyser en mode fullscan.

II.4.3.d. Mode opératoire pour l’analyse quantitative.

Les SI sont ajoutés en quantités connues dans les fractions aromatique, aliphatique et polaire. Les SI ajoutés dans la fraction aliphatique sont les n-alcanes perdeutérés en C16, C20, C24 et C30 et le cholestane d6. Les SI ajoutés dans la fraction aromatique sont le naphtalène d8, l’acénaphtène d10, le phénanthrène d10, le chrysène d12 et le pérylène d12. Les SI ajoutés

dans la fraction polaire sont les n-alcanes perdeutérés en C16, C20, C24 et C30, le naphtalène d8, l’acénaphtène d10, le phenanthrène d10, le chrysène d12, le perylène d12 et le cholestane d6. Ils y sont ajoutés avant la réaction de dérivatisation au BSTFA + TMCS.

Les solutions sont alors analysées par CPG – SM en mode fullscan. Les aires des molécules à quantifier et des SI sont récupérées en intégrant les signaux correspondant à ces molécules. Etant à volume constant, l’équation III.5 devient l’équation III.5’ qui peut se transformer en équation III.5’’:

(Equation III.5’) Aire M / Aire SI = K . m M / m SI + constante’’ (Equation III.5’’) m M = (Aire M / Aire SI - constante’’) . m SI / K

La masse de molécule M est obtenue en injectant les aires et la masse de SI dans l’équation III.5’’ dont les constantes sont obtenues par calibration. Quelle que soit la molécule à quantifier, il faut choisir le standard interne le plus proche en termes de nature chimique et de temps de rétention (Table III.1). La masse déterminée correspond à la quantité de molécule M dans la fraction analysée. Pour obtenir la teneur en molécule par rapport à la matrice analysée, il faut corriger par les différents volumes et par la masse de matrice analysée.

La quantification n’est juste que pour les molécules dont l’équation de calibration a été déterminée donc pour les molécules disponibles au laboratoire. La quantification des autres molécules passe par l’approximation des coefficients de corrélation à partir des coefficients de molécules structurellement proches.

Standards Internes Marqueurs Moléculaires

Naphtalène d8 Naphtalène et alkyl naphtalène

Acénaphtène d10 Acénaphtylène, acénaphtène, fluorène, biphényl, dibenzofurane et leurs formes alkylées Phénanthrène d10 ^{Phénanthrène, anthracène, fluoranthène, pyrène, phényl-naphthalène, benzonaphtho} _{furane, Me-phenanthrofuran, fluorénone, azafluorène, dibenzothiophène, sulfobenzide,}

C2-naphtothiophène, anthrone, naphtopyranone, anthraquinone, leurs isomères et formes alkylées

Chrysène d12 ^{Benzo(a)anthracène, triphénylène, chrysène, pyrenofuran, cyclopenta(def)} _{phénanthrenone, phénindione, phénanthropyranone, benzanthrone, naphtacènedione,} cyanoanthracène, benzocarbazole, benzoacridine, benzonaphtothiophène, leurs isomères et formes alkylées

Pérylène d12 ^{Benzo(b,j et k)fluoranthène, benzo(a et e)pyrène, pérylène, dibenzo(a,h)anthracène,} _{indéno(1,2,3-cd)pyrène, benzo(g,h,i)pérylène, binaphthyl, cyclopentachrysénone,} indenoanthracénone, benzonaphthacènedione et leurs isomères

Cholestane d6 Stérols, stanols, hopanes et terpanes tricycliques

n-C16D34 Pristane, n-alcanes du C14 au C17, C12n-alcanol et C12 acide n-alcanoïque

n-C20D42 Linear alkyl benzènes, néophytadiènes, phytane, n-alcanes du C18 au C22, phytol,

phytone, C14 à C17n-alcanols et C14 au C16 acide n-alcanoïque

n-C24D50 n-Alcanes du C23 au C26, n-alcanols du C18 au C23 et acide n-alcanoïque du C17 au C22

n-C30D62 n-Alcanes du C27 au C40 et n-alcanols du C24 au C30

Quatrième partie : Approche multimoléculaire :

Principe et Applications.

I. Classification des marqueurs moléculaires.

La matière organique des sédiments de rivière est composée de la somme des apports autochtones et allochtones. Aux apports allochtones naturelles (essentiellement issus des végétaux supérieurs et des micro-organismes) sont associés les apports allochtones anthropiques qui proviennent du lessivage des surfaces continentales, des retombées atmosphériques et des apports anthropiques directs intentionnels, tels que les rejets des stations d’épuration dont les traitements peuvent parfois être incomplets notamment lors des périodes de forts débits, ou accidentels. Dans la vallée de la Fensch, les apports anthropiques directs sont les rejets des stations d’épuration (STEP) industrielles des usines de Corus Rail à Hayange (1 STEP) et de Sollac Lorraine et Usinor Packaging à Hayange et à Sérémange (4 STEP) et à Ebange-Florange (6 STEP) ainsi que la station d’épuration domestique traitant les eaux usées du Val de Fensch (taux de couverture sur le bassin versant : 80 %).

Figure IV. 1 : Représentation schématique de la répartition des marqueurs moléculaires.

Les molécules non liées par des intéractions fortes aux macromolécules organiques et aux phases minérales sédimentaires ont été séparées par chromatographie en phase gazeuse couplée et identifiées par spectrométrie de masse (cf. partie III). Ces molécules ont été classées selon leurs origines (1) en marqueurs naturels, (2) en molécules issues des procédés de combustion, (3) en molécules provenant de matière organique fossile non brûlée ou

Marqueurs de la combustion: HAP de HPM et cétones aromatiques Marqueurs des eaux usées: Coprostanol, épicoprostanol, coprostanone et linear alkyl benzènes

Marqueurs pétrogénétiques: Hopanes, stéranes, terpanes tricycliques, UCM, n-alcane (CPI ~ 1), HAP de BPM, HAP alkylés Marqueurs naturels: Phytostérols, n-alcane (CPI > 4), n-alcanols, acidesn-alcanoïques, phytol, phytone, néophytadiènes Cholestérol, α-cholestanol, n -C₁₆et n-C₁₈acides alcanoïques Pérylène Phénanthrène, azaarènes, fluorénone, périnaphthénone Sources Potentielles de matière organique Marqueurs de la combustion: HAP de HPM et cétones aromatiques Marqueurs des eaux usées: Coprostanol, épicoprostanol, coprostanone et linear alkyl benzènes

Marqueurs pétrogénétiques: Hopanes, stéranes, terpanes tricycliques, UCM, n-alcane (CPI ~ 1), HAP de BPM, HAP alkylés Marqueurs naturels: Phytostérols, n-alcane (CPI > 4), n-alcanols, acidesn-alcanoïques, phytol, phytone, néophytadiènes Cholestérol, α-cholestanol, n -C₁₆et n-C₁₈acides alcanoïques Pérylène Phénanthrène, azaarènes, fluorénone, périnaphthénone Sources Potentielles de matière organique

pétrogénétiques et (4) en marqueurs des eaux usées (Figure IV.1). Toutefois, certaines molécules peuvent être caractéristiques de plusieurs catégories. Dans ce dernier cas, elles ont été classées sous l’appellation : « non spécifique ».

Cette première partie du chapitre IV a pour but (1) de présenter les différentes molécules ou familles de molécules détectées dans les sédiments, les matières en suspension et les eaux prélevés dans la Fensch et la Moselle et (2) d’introduire plusieurs rapports moléculaires, fréquemment utilisés dans les études environnementales et notamment dans le cadre de ce travail.