Discussion générale
2) La protéine potentiellement sécrétée
Comme chez son homologue K8.1 du KSHV, un phénomène d’épissage alternatif a lieu au cours de la transcription du gène Bo10. Chez le KSHV, ce processus est à l’origine de trois transcrits différents (Figure 9) dont le prédominant, dans les cellules BCLB-1, est celui codant pour l’homologue de gp180, K8.1.A (Raab et al., 1998). Chez le BoHV-4, des sites uniques donneur et accepteur d’épissage encadrent l’intron du gène Bo10 et peuvent générer deux transcrits différents.
Alors que le transcrit épissé conduit à la production de gp180, l’absence d’épissage permet la lecture d’un codon stop au niveau de l’intron. La traduction de ce transcrit non épissé conduirait à la formation d’une protéine plus courte que gp180 et ne disposant pas d’ancre transmembranaire. De manière intéressante, le transcrit non épissé du KSHV (K8.1γ) présente la même caractéristique. Ainsi, comme pour le BoHV-4, la traduction potentielle de cet ARNm produirait une protéine tronquée. Etant donné que ce potentiel produit tronqué n’a jamais été étudié chez le KSHV, la caractérisation de son homologue chez le BoHV-4 présente un intérêt majeur.
Au cours de ce travail, plusieurs outils ont été constuits. Ils devraient nous aider d’une part, à identifier et à caractériser la protéique tronquée potentielle et d’autre part, à comprendre le(s) rôle(s) qu’elle joue dans l’infection du BoHV-4. Certains résultats pourraient potentiellement être extrapolés chez d’autres gammaherpèsvirus. La construction puis la caractérisation in vitro des virus recombinants ne générant que l’un ou l’autre des transcrits (Mudir versus Spliced), ont révélé que seule la glycoprotéine gp180 était impliquée dans l’attachement du virus aux GAGs (Etude IV, figure 3). Ces expériences préliminaires n’ont pas mis en évidence de phénotype particulier associé à l’absence seule du transcrit non épissé. Cependant, des investigations supplémentaires in vitro et in vivo sont nécessaires pour confirmer ces observations et pour discerner le rôle de chacune des formes.
Bo10 en fonction du moment du cycle viral, du type de cellules hôtes ou encore, de l’expression de certains gènes viraux. A ce titre, une étude récente, menée chez le KSHV, a mis en évidence le rôle de l’ORF57 dans la régulation de l’expression de plusieurs gènes viraux au cours de l’infection lytique.
Ainsi, cette ORF semble moduler le phénomène d’épissage de plusieurs gènes parmi lesquels figure K8.1 (Majerciak et al., 2007). La caractérisation de la transcription de Bo10 pourrait mettre en évidence un déséquilibre dans la proportion des deux transcrits produits, sous l’influence de différents facteurs de l’environnement. Cette régulation fine serait une façon élégante pour le virus d’orienter son tropisme. De manière similaire à l’EBV qui utilise la glycoprotéine gp42, présente ou non à sa surface, pour “switcher” d’un type cellulaire à l’autre (Borza & Hutt-Fletcher, 2002; Kirschner et al., 2006), le BoHV-4 pourrait diminuer la production du transcrit épissé pour moduler son tropisme cellulaire. Le phénomène d’épissage de Bo10 permettrait au virus présentant gp180 à sa surface d’infecter aisément les cellules GAG positives tandis que l’absence d’épissage orienterait l’infection du virus vers les cellules GAG-, telles que les monocytes. Pour tester cette hypothèse, une analyse quantitative, des cDNA obtenus à partir de différents types de cellules infectées, sera réalisée.
Outre un rôle indirect potentiel dans la régulation de la présence de gp180 dans l’enveloppe virale, le transcrit non épissé pourrait encoder une protéine avec une fonction propre. La séquence peptidique correspondant au transcrit non épissé ne présente pas de domaine hydrophobe prédit pour une ancre transmembranaire. Aussi, il serait intéressant de déterminer si la protéine est incorporée dans la particule virale ou si elle est sécrétée dans le milieu extracellulaire. Pour adresser cette question, une première expérience consistera à détecter puis à caractériser la protéine potentielle que ce transcrit non épissé génère. A cette fin, des sera monospécifiques de chacune des formes ont été produits (données non présentées). Grâce à ces Ac, l’analyse par western blot du surnageant de cellules infectées pourrait permettre l’identification de la protéine potentiellement sécrétée. Cependant, ces Ac étant produits sur base d’un épitope séquentiel de chacune des formes, ils pourraient ne pas reconnaître les protéines sous leur conformation tridimensionnelle. Pour faire face à cette difficulté éventuelle, un virus recombinant, exprimant la protéine “tronquée”, modifiée par un “tag “ sera construit. L’analyse par western blot, de virions purifiés et de surnageant de cellules infectées par ce virus recombinant, au moyen d’Ac dirigés contre le “tag”, devrait dès lors permettre de détecter la protéine et de révéler si elle est sécrétée dans le milieu extracellulaire et/ou intégrée dans la particule virale.
Plusieurs rôles distincts peuvent être suggérés pour cette protéine tronquée. Par analogie avec les propriétés de gp180, cette forme plus courte pourrait également lier les GAGs et améliorer la sortie des néo-virions. En effet, le modèle proposé de fixation de gp180 aux GAGs de la surface cellulaire soulève quand même une interrogation: comment les virions néoformés, présentant la gp180 à leur surface, ne sont pas directement réattachés à la cellule qui les a produits? Une stratégie pour
des virions. Cependant, une protéine différente de gp180 (Etude I, figure 7) désignée sous le nom de gp8, est elle-aussi, capable de lier les HS (Vanderplasschen et al., 1993). Présente sous une forme sécrétée, gp8 constitue un autre candidat potentiel pour améliorer la libération des néo-virions.
Selon nos hypothèses, le BoHV-4 pourrait être capable de générer deux types de virions différents: l’un expimant gp180 à sa surface et l’autre exprimant la forme tronquée de Bo10. Pour échapper à la reconnaissance du système immunitaire, ces deux types de virus devraient avoir évolué pour se protéger des Ac neutralisants. Nous ayons démontré un rôle du gène Bo10 dans la protection de la neutralisation par les Ac. Bien que nous avons associé ce phénotype à gp180, nos données n’excluent pas cependant, une implication de la forme tronquée dans cette même évasion de la réponse humorale. Dans cette hypothèse, le virus pourrait, de manière particulièrement ingénieuse, orienter son tropisme tout en restant protégé de la neutralisation par les Ac.
D’autres fonctions peuvent encore être envisagées. Le virus EBOLA, par un phénomène
“d’ARN editing”, est capable de générer des forme transmembranaire (GP) ou sécrétées (SGP, ssGP) de la glycoprotéine EBOV GP (Mehedi et al., 2011; Volchkov et al., 1995). La fonction de ces formes sécrétées n’est pas bien définie à l’heure actuelle mais un rôle de leurre immunologique détournant la cible des Ac a été proposé (Dolnik et al., 2004; Ito et al., 2001). Une telle fonction pourrait également s’appliquer au produit tronqué du gène Bo10. Dans ce cadre, une première étape pourrait être de caractériser le profil de glycosylation de la forme sécrétée potentielle afin de mettre en évidence une possible différence avec la forme transmembranaire. Tel que mentionné précédemment, des résultats préliminaires ont suggéré une modification de la glycosylation de gp180 par pBo17. Cependant, l’activité enzymatique de pBo17 pourrait aussi être distincte, voire absente au niveau de la protéine tronquée encodée par Bo10. En effet, la transcription du gène Bo17 est également modulée par un phénomène d’épissage alternatif. Aussi, la régulation de l’épissage de Bo17 pourrait être corrélée avec celle de Bo10. Dans cette hypothèse, les deux formes protéiques, dérivées du même gène Bo10, pourraient afficher un profil de glycosylation tout à fait différent selon les circonstances. L’exposition différente des glycans au niveau de gp180 et de la protéine tronquée pourrait induire des variations au niveau de leur profil antigénique respectif et attribuer à ces deux formes, des rôles distincts.
En conclusion, cette étude s’est penchée sur les rôles du gène Bo10 au cours de l’infection du BoHV-4. La première caractérisation de la protéine d’enveloppe (gp180) encodée par ce gène a démontré son implication dans l’entrée et dans l’orientation du tropisme viral par une régulation positive et négative. Par l’exposition d’un bouclier de O-glycans, cette protéine assure la protection du virion vis-à-vis de la neutralisation par les Ac spécifiques de l’hôte. Cependant, l’exposition massive des épitopes gal sur les glycans de cette même protéine rend le BoHV-4 sensible à la neutralisation par
alternatif. Le rôle de cette dernière n’est pas encore défini mais la mise en place de plusieurs outils nous permettra à l’avenir d’investiguer cette question. Les résultats générés au cours de cette étude ainsi que les perspectives entrouvertes, pourraient avoir dans le futur, des implications tant fondamentales qu’appliquées.
Figure 8.La glycoprotéine gp180 forme un bouclier de glycans au devant de plusieurs épitopes de gB, gH et gL dont certains sont sensibles à la neutralisation. L’interaction de gp180 avec les glycosaminoglycans de la surface cellulaire permettrait le déplacement de celle-ci, révélant alors les épitopes nécessaires à la fusion du BoHV-4.