La problématique

5.1 Estudo da atividade citotóxica

O estudo da atividade citotóxica da CG foi realizado em células humanas tumorais e em células humana normais.

5.1.1 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células tumorais humanas

A avaliação do potencial citotóxico da CG foi realizada em 5 linhagens de células tumorais humanas (HL-60 - leucemia promielocítica, HCT-8 – carcinoma de

cólon, SF-295 – glioblastoma, MDA-MB-435 – melanoma e K562 – leucemia mielóide

crônica), através do método do MTT após 72 horas de incubação. A doxorrubicina foi usada como controle positivo em todos os experimentos.

Os resultados encontrados no ensaio de citotóxico da CG, em células tumorais humanas estão apresentados na Tabela 3. CG apresentou elevado potencial de citotoxicidade em todas as linhagens tumorais testadas, com valores de CI50 que

variaram de 0,48 µg/mL (1,89 µM) em Hl-60; 0,30 µg/mL (1,18 µM) em HCT-8; 0,84

µg/mL (3,32 µM) em SF-295; 0,45 µg/mL (1,77 µM) em MDA-MB-435 e 0,43 µg/mL

(1,69 µM) em K562. A doxorrubicina, usada como controle positivo, também

apresentou citotoxicidade em todas as linhagens tumorais testadas, com valores de CI50 que variaram de 0,01 µg/mL (0,02 µM) a 0,48 µg/mL (0,88 µM) para as linhagens

de HCT-8 e MDA-MB-435, respectivamente. Para este ensaio, foram consideradas citotóxicas aquelas substâncias que apresentaram CI50 < 1 µg/mL (3,95 µM).

98

Tabela 3: Atividade citotóxica da CG frente às linhagens tumorais. Células humanas

de leucemias (HL-60, K562), carcinoma de cólon (HCT-8), glioblastoma (SF-295) e carcinoma de mama (MDA-MB-435). A Doxorrubicina foi usada como controle positivo.

*Valores de IC50 em µg/mL (µM) originados de experimentos independentes (n=3) da CG

obtidos pelo ensaio do MTT em painel de linhagens celulares após 72h de incubação. Os dados foram obtidos por regressão não-linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

5.1.2 Avaliação da atividade citotóxica da CG em células normais humanas (PBMC)

Para a avaliação da seletividade em células normais humanas, a atividade citotóxica da CG foi avaliada em PBMC (peripheral blood mononuclear cell – linfócitos e monócitos) pelo método alamar blue com 24, 48 e 72 horas de incubação.

Os resultados encontrados estão descritos na Tabela 4, que apresenta o potencial citotóxico da CG, em células normais humana.Quando a atividade citotóxica

da CG foi avaliada em células humanas normais (PBMC), o valor de CI50 encontrado

foi de10,51 µg/mL (41,54 µM) em 24 horas; 2,29 µg/mL (9,05 µM) em 48 horas e 1,79

µg/mL (7,07 µM) em 72 horas. Assim, a CG apresenta um índice de citotoxicidade em PBMC que aumenta com o tempo de exposição à substância.

Entretanto, comparando a CI50 da CG em HL-60 (Tabela 3), utilizada como

modelo nos demais testes biológicos, com a CI50 em PBMC após 72 h de incubação

(Tabela 4), observou-se que a citotoxicidade foi maior em células HL-60 do que em PBMC.

Substâncias Linhagem Celular-CI

50

[µg/mL] (µM)

HL-60

HCT-8

SF-295

MDA-MB-

435

K562

CG

0,48 (1,89) 0,26-0,82* 0,30 (1,18) 0,20-0,47* 0,84 (3,32) 0,6-1,19* 0,45 (1,77) 0,34-0,60* 0,43 (1,69) 0,23-1,35*

99

Tabela 4: Atividade citotóxica da CG frente à linhagem normal obtida de cultura

primária (PBMC) após 24, 48 e 72 horas de incubação.

Substância

Linhagem Celular- CI

50

[µg/mL] (µM)

PBMC

24 horas 48 horas 72 horas

CG

10,51 (41,54) 2,29 (9,05) 1,79 (7,07) _{6,07-18,19* 1,67-3,14* 1,16-2,77*}

*A tabela apresenta os valores de CI50 em µg/mL (µM) originados de experimentos

independentes (n=3) obtidos por regressão não-linear com intervalo de confiança de 95% através do programa GraphPad Prisma versão 5.0 (Intuitive Software for Science, San Diego, CA, EUA).

5.2 Atividade hemolítica

Este ensaio permite avaliar o potencial das substâncias em causar lesões na membrana plasmática da célula, seja pela formação de poros ou pela ruptura total, por meio da utilização de eritrócitos de camundongos (Costa-Lotufo et at., 2002).

A substância CG nas concentrações testadas não foi capaz de causar hemólise (Tabela 5) em eritrócitos de camundongos, desta forma, pode-se inferir que a atividade citotóxica não é dependente de lise imediata da membrana plasmática, podendo estar relacionado com um mecanismo de morte celular mais específico.

Tabela 5: Avaliação do potencial hemolítico da CG frente a eritrócitos de

camundongos Swiss (Mus musculus).

Substância-Teste

EC50 µg/mL (µM)

CG

>200 µg/mL (790,5µM)

*EC50: Concentração efetiva em que a substância-teste causa hemólise em 50% dos eritrócitos.

100

5.3 Estudo do mecanismo de ação citotóxica em células HL-60

A fim de investigar os possíveis mecanismos envolvidos na citotoxicidade da CG, células de HL-60, linhagem leucêmica, (0,3 x 106 _{células/mL) foram utilizadas}

como modelo, após 24 horas de incubação com o composto teste nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, na maioria dos experimentos, baseadas nos valores de CI50. A

doxorrubicina (Dox) na concentração de 0,5 µM foi utilizada como controle positivo.

Foram avaliados a viabilidade celular por exclusão do azul de tripan, o padrão de morte celular por coloração diferencial com Brometo de Etídio e Laranja de Acridina, a síntese de DNA pelo ensaio do BrdU e a morfologia celular pela Coloração diferencial com May-Grunwald-Giemsa. Em seguida, a viabilidade celular, a integridade de membrana e o conteúdo de DNA nuclear da célula, que reflete as fases do ciclo celular, foram analisados por citometria de fluxo. O efeito da CG sobre a ativação das caspases- 3, 7, 8 e 9 também foi avaliado por citometria de fluxo. Por fim, a expressão do Citocromo C foi detectada pelo método do Western blot.

5.3.1 Determinação da viabilidade celular por exclusão do azul de Tripan

Este ensaio é um método direto de avaliação da viabilidade celular após o tratamento com o composto teste. A análise dos resultados permite verificar que o composto CG na concentração de 0,04 µM não foi capaz de reduzir a viabilidade de células HL-60 em nenhum tempo de incubação investigado. Adicionalmente, CG nas concentrações de 0,2; 0,4 e 2,0 µM reduziram significativamente (p<0,05) o número de células viáveis apenas após 24 h de incubação. Já na maior concentração testada (4,0 µM), CG promoveu redução significativa (p<0,001) e similar após 6 e 12 h de incubação (68,59 ± 6,70%), sendo este efeito maior após 24 h de incubação, com uma redução de (41,65 ± 3,13%) em relação ao controle, o que resulta numa diferença de 58,4 % no número de células viáveis (Figura 15).

101

0 3 6 9 12 15 18 21 24 0 25 50 75 100 125 controle 0,04_M 0,2_M 0,4_M 2,0_M 4,0_M ** * ** * * * Tempo de incubação (h) Cé lu la s vi áv ei s (% )

Figura 15: Curva de crescimento em células leucêmicas humanas (HL-60), tratadas com o composto CG nas concentrações 0,04 µM; 0,2 µM; 0,4 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A viabilidade das células leucêmicas foi determinada por exclusão de azul de tripan em 3, 6, 12 e 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), * p< 0,05; ** p<0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

5.3.2 Coloração diferencial por Laranja de Acridina / Brometo de Etídio

Para investigar o padrão de morte celular (apoptose ou necrose) envolvido na atividade citotóxica da CG realizou-se a coloração diferencial com laranja de acridina e brometo de etídio (LA/BE) por microscopia de fluorescência. O percentual de células viáveis, apoptóticas e necróticas foi então calculado.

Para confirmar que a atividade antiproliferativa do composto testado está relacionada com a indução de apoptose e necrose, a análise morfológica das células tratadas foi investigada utilizando a coloração diferencial de laranja de acridina e brometo de etídio (LA/BE) por microscopia de fluorescência. O percentual de células viáveis, apoptóticas e necróticas foi então calculado. Os resultados demonstraram que as células não-tratadas com CG (grupo controle) apresentaram um percentual de 97,67 ± 0,69 % de células viáveis (coloração verde uniforme e morfologia normal) (Figura 16). O tratamento das células com o composto CG, na menor concentração testada (1,0 µM), causou poucas alterações significativas no padrão morfológico de células HL-60 quando comparadas ao controle negativo. No entanto, a partir da concentração intermediária (2,0 µM) foi observado um aumento de 60,44 ± 0,80% na percentagem de células em processo de apoptose. Já na maior concentração (4,0 µM), a CG causou uma redução da percentagem de células viáveis. Essa redução foi

102

acompanhada por um aumento de 94 ± 0,19% de células com características de apoptose e apenas um discreto aumento de 3,11 ± 0,11% de células em necrose estatisticamente significativo (p<0,001). Já a doxorrubicina causou 91,22 ± 0,48% (p<0,001) de apoptose, diminuindo visivelmente o percentual de células viáveis (Figura 16).

C

Dox

1,0

2,0

4,0

0

25

50

75

100

Viável

Apoptose

Necrose

CG

(M)

**

**

**

**

**

**

**

**

**

Cé

lu

la

s

(%

)

Figura 16: Determinação dos percentuais sobre os eventos celulares (viabilidade celular, apoptose e necrose) avaliado em células leucêmicas humanas (HL-60), tratada com o composto CG nas concentrações 1,0 µM; 2,0 µM e 4,0 µM. A análise foi realizada após 24 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (DOX). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=3), **p< 0,001 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

5.3.3 Inibição da proliferação celular através da incorporação de BrdU

Para relacionar a atividade antiproliferativa dos compostos testados à inibição da síntese de DNA foi realizado o ensaio de incorporação do BrdU. Neste ensaio foi observado que células HL-60 tratadas com o derivado de chalcona (CG), onde nas concentrações testadas (1,0 e 2,0 µM) mostram que as células viáveis existentes marcadas no núcleo com coloração marrom destacam a incorporação com o BrdU, com diferença significativa em relação ao controle negativo (70,13 ± 1,18%), com 66,63 ± 3,35% e 72,63 ± 4,0%; respectivamente (Figura 17 e 18). A doxorrubicina, utilizada como controle positivo, causou 54,38% (15,75 ± 0,86) de inibição da proliferação celular em relação ao controle negativo (Figura 17). A maior concentração

103

da CG (4,0 µM) causou destruição celular tão intensa ao ponto de impossibilitar a contagem de células. Por esse motivo, decidiu-se avaliar a inibição da síntese de DNA apenas na concentração corresponde à CI50 e metade dela.

C Dox 1.0 2.0 0 50 100

CG

(M)

70,13 ± 1,18 15,75 ± 0,86 66,63 ± 3,35 72,63 ± 4,0

*

*

*

C

él

ul

as

(%

)

Figura 17: Determinação do percentual de síntese do DNA. Foi avaliado pela incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU) nas células HL-60, após 24 horas de incubação. As células foram tratadas com o composto CG nas concentrações 1,0 µM e 2,0 µM. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado para a diluição da substância (DMSO). A doxorrubicina – 0,5 µM – foi utilizada como controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± EPM de experimentos independentes (n=2), *p< 0,05 comparado ao controle por ANOVA seguido pelo teste Student Newman-Keuls.

Figura 18: Fotomicrografias das lâminas das células de HL-60, tratadas e não tratadas, após 24 horas de incubação com a doxorrubicina e CG. A- Controle negativo (DMSO), B- tratadas com Doxorrubicina (0,5 µM), C- 1,0 µM e D- 2,0 µM. A contagem foi realizada através da incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU), células com núcleos de coloração marrom. O aumento foi de 400X.

104

5.3.4 Coloração diferencial por May-Grunwald-Giemsa

A análise por microscopia das células HL-60, coradas com May-Grunwald- Giemsa, revelou diversas mudanças morfológicas induzidas pela CG e Doxorrubicina. Após 24 horas em cultura, células HL-60 do grupo do controle (não-tratadas) exibiram uma morfologia típica de células não aderidas, tais como membrana íntegra, células pleomórficas, nítida visualização tanto da membrana plasmática quanto nuclear (Figura 19A). As células tratadas com a Dox (0,5 µM), utilizada como controle positivo, induziu redução do volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear em células de HL-60, todas as características condizentes com apoptose (Figura

19B). Já as células tratadas com a menor concentração da CG (1,0 µM), observou-se

pouca diferença estrutural das células em relação ao controle negativo (Figura 19C). Nas duas maiores concentrações testadas de CG (2,0 e 4,0 µM), apresentaram mudanças morfológicas consistentes com processo de apoptose incluindo redução do volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear, sendo que na maior concentração (4,0 µM), observa-se um padrão semelhante, produzindo características e redução de células viáveis muito próximas ao controle positivo tratado com doxorrubicina (Figura 19D e E).

Figura 19: Fotomicrografias das células de HL-60 tratadas e não tratadas, após 24 h de incubação com a CG e coradas com May-Grunwald-Giemsa. O aumento foi de 400X. A- Controle negativo, B- doxorrubicina a 0,5 µM, C- 1,0 µM (CG), D- 2,0 µM (CG) e E- 4,0 µM (CG). As setas pretas indicam redução de volume celular, condensação de cromatina, fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos “blebs”.

105

5.3.5 Análises da citometria de fluxo

5.3.5.1 Integridade de membrana celular e concentração de células

A determinação da viabilidade celular serviu como parâmetro para avaliar a integridade de membrana plasmática de células com morfologia normal, esse teste foi realizado por citometria de fluxo utilizando o Iodeto de Propídeo (PI) como agente fluorogênico. A doxorrubicina (0,5 μM) foi usada como controle positivo em todos os experimentos. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância. Foram utilizadas, neste estudo, as concentrações (1, 2 e 4 μM) da CG. As células foram analisadas 24 h após a incubação com a substância teste.

Na avaliação da viabilidade celular, onde foi utilizado iodeto de propídeo como corante hidrofílico permeável somente em células com membrana rompida, foi observado perda da integridade da membrana citoplasmática, com 53,5% a partir de

24 horas de incubação com a maior concentração de CG testada, 4,0 µM(Figura 20A)

em relação ao controle negativo. A integridade de membrana foi afetada tanto na concentração de 2,0 µM (75,18 ± 3,25%) como na concentração de 4,0 µM (43,29 ± 2,68%) em relação ao controle negativo. A doxorrubicina, por sua vez, reduziu a proliferação celular com pouca alteração da integridade da membrana citoplasmática 96,79 ± 0,22% (Figuras 20A e B). Como observado na Figura 20B, a CG causou uma redução significativa na proliferação celular, de maneira dose-dependente, com 24 horas após a incubação, onde nos tratados com doxorrubicina (0,5 µM), CG (2,0 µM e 4,0 µM) foram significativos (p<0,001) .

Esses dados confirmam os resultados observados através dos testes de MTT, viabilidade por exclusão do azul de tripan e coloração por May-Grunwald-Giemsa e LA/BE.

106

Figura 20: A- Avaliação da integridade de membrana plasmática e B- Avaliação do número de células viáveis, analisados por citometria de fluxo. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM e com o controle doxorrubicina a 0,5 µM. Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

5.3.5.2 Análise do ciclo celular e da fragmentação de DNA

A progressão do ciclo celular e a fragmentação internucleossomal do DNA das células HL-60, tratadas com CG, foram realizadas por citometria de fluxo e analisadas através do programa ModFit LT 3.1. Os resultados mostraram que tanto o controle positivo (doxorrubicina) quanto às duas maiores concentrações de CG, 2,0 e 4,0 µM causaram aumento significante na fragmentação de DNA (p < 0,05). Após 24 horas de exposição, células não tratadas apresentaram 4,36 ± 0,37% de fragmentação de DNA, enquanto as células tratadas com CG nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM causaram 22,54 ± 2,50% e 48,49 ± 2,60%, respectivamente. A menor concentração da CG 1,0 µM não causou fragmentação significativa do DNA. Já a doxorrubicina (Dox), utilizada como controle positivo, mostrou 90,41 ± 2,06% das células com DNA fragmentado (Figura 22A).

Quanto à progressão das fases do ciclo celular, as células tratadas com CG tiveram diferenças significativas nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM, com 40,77% e 40,51% em relação ao controle negativo 50,88%, mostrando que não houve parada na fase G0/G1. Já a doxorrubicina, promoveu uma parada na fase G0/G1 de 90% em

107

relação ao controle negativo e intensa fragmentação do DNA. Já na fase S, A CG não demonstrou diferença significativa em ralação ao controle, bem como as células tratadas com doxorrubicina. Na fase G2/M, a maior concentração testada (4,0 µM),

apresentou parada nesta fase de 20,87 ± 1,20% com diferença significativa (p<0,05) (Figura 21 e 22B).

Figura 21: Efeito da CG no ciclo celular após 24 h de incubação. Os histogramas do ciclo celular foram analisados no ModFit LT 3.1. Eixo x: intensidade de fluorescência e eixo y: números de células de HL-60, determinadas por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. A- Controle negativo; B- Doxorrubicina (0,5 µM); C, D e E- CG nas concentrações 1,0; 2,0 e 4,0 µM.

108

Figura 22: A- Determinação da fragmentação do DNA; B- Análise do efeito sobre o ciclo celular. Células de HL-60 incubadas com a CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, após 24 h de incubação e analisados por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo. (C-) representa o controle negativo; (DOX) controle positivo com Doxorrubicina (0,5 µM). Os dados foram analisados a partir da média ± EPM de 3 experimentos. Para a verificação da ocorrência de diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

109

5.3.5.3 Determinação da Externalização da Fosfatidilserina- Anexina V

A fim de confirmar o tipo de morte celular induzida pela CG, a externalização da fosfatidilserina foi avaliada por citometria de fluxo. A Anexina V liga-se a fosfatidilserina, reconhecendo desta forma as células em apoptose. A exposição da fosfatidilserina é para sinalizar a fagocitose das células apoptóticas. O Figura 23B mostra que há uma diminuição das células viáveis concentração-dependente nas concentrações de CG de 2,0 e 4,0 µM, com 79,36 ± 1,71% e 50,57 ± 2,28%, respectivamente, estatísticamente significativo, *p<0,05. Como observado na Figura

23A e B, houve uma indução da externalização da fosfatidilserina de forma

concentração dependente, quando analisamos a indução de apoptose inicial mais a tardia, com 8,53% e 15,27%; 10,25% e 33,63%, respectivamente, sendo significativo nas maiores concentrações (2,0 e 4,0 µM), com *p<0,05.

A CG aumentou o percentual de células em processo tardio a necrose, nas concentrações de 2,0 e 4,0 µM da CG, com 4,4% e 6,0% em relação ao controle negativo, *p<0,05 (Figura 23A e B). Já a doxorrubicina (0,5 µM) apresentou aumento significativo na porcentagem de células em apoptose inicial e tardia, com 32,44% e 65,15%, respectivamente (Figura 23A e B).

110

Fi

gura 23: Análise da externalização da fosfatidilserina por citometria de fluxo em células HL- 60. No histograma (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Gráfico (B): % de células viáveis, em apoptose inicial, apoptose tardia e necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

111

5.3.5.4 Detecção da ativação de Caspases Efetoras _{– 3 e 7}

A ativação da caspase-3 foi avaliada por ensaio colorimétrico. A doxorrubicina (0,5 µM) foi usada como controle positivo em todos os experimentos. O controle negativo foi tratado com o veículo (DMSO) usado para diluir a substância. As concentrações (1,0; 2,0 e 4,0 µM) utilizadas da CG neste estudo foram previamente determinadas. As células foram analisadas 24 horas após a incubação com o derivado de chalcona (CG).

Como demonstrado na Figura 24A, houve uma diminuição estatiticamente significativa (p<0,001) no número de células viáveis, nas células tratadas com CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM, 84,88 ± 2,65%, 43,74 ± 0,99% e 20,98 ± 1,34%, respectivamente. O controle positivo, doxorrubicina 0,5 µM, mostrou um percentual de 20,09 ± 1,43%, resultado este muito próximo a dose maior da CG (4,0 µM). Com relação aos valores de apoptose inicial e tardia, observamos que nas maiores concentrações da CG (2,0 e 4,0 µM) houve um aumento significante (**p<0,001) em relação ao controle negativo, 15,34 ± 1,6% e 14,77 ± 0,36% apoptose inicial; 18,36 ± 4,21% e 43,61 ± 3,13% apoptose tardia (Figuras 24 e 25).

Na avaliação da necrose as maiores concentrações da CG aumentaram o percentual da mesma em 15,69 ± 3,08% e 17,87 ± 2,09%, respectivamente (Figura

24D e 25- 4 e 5). A Caspase 3 e 7 foi ativada pela doxorrubicina 0,5 µM e CG 2,0 e 4,0

µM.

Fi

gura 24: Análise da detecção das Caspases Efetoras 3 e 7 por citometria de fluxo em células HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de

Viáveis Apoptose Inicial

112

variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (**p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

Fi

gura 25: Histograma referente ao teste das Caspases Efetoras 3 e 7. (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM (respectivamente 3, 4 e 5) com 24 horas de incubação. Percentagem de células em: Verde- quadrante inferior esquerdo – viáveis; Azul- quadrante inferior direito- apoptose inical; Rosa- quadrante superior direito- apoptose tardia; e Roxo- quadrante superior esquerdo- necrose. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p<0,05), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

5.3.5.5 Detecção da ativação de Caspases Iniciadoras -8/-9

Como mostrado nas Figuras 26 e 27, a Caspase- 8 demonstrou comportamento semelhante ao encontrado nas Caspase- 3/-7. Houve diminuição de células viáveis em todas as concentrações testadas de forma significante (p<0,05), doxorrubicina 0,5 µM (28,47 ± 2,65%), CG 1,0; 2,0 e 4,0 µM (27,19 ± 5,15%; 18,43 ± 0,24% e 21,26 ± 4,00%). Aumentou o número de células apoptóticas iniciais e tardias (*p<0,05 e **p<0,001), embora esse aumento tenha somente ocorrido com significância na apoptose inicial nas células tratadas com doxorrubicina (26,02 ± 2,10%) (Figura 26B). Já na apoptose tardia tanto a doxorrubicina quanto as concentrações de CG testadas aumentaram o percentual em 26,43 ± 3,82% (DOX- 0,5 µM); 40,41 ± 4,88%, 30,60 ± 7,96% e 44,55 ± 4,94% (CG- 1,0; 2,0 e 4,0 µM) em relação ao controle negativo (Figuras 26 e 27- 2, 3, 4 e 5).

Na necrose, o aumento do percentual ocorreu de forma significativa na doxorrubicina, similarmente na dose de 4,0 µM da CG. Porém, na dose correlacionada a CI50 (2,0 µM) também houve aumento de 7,19 ± 0,47% (Figuras 26D e 27-4).

113

Na avaliação da Caspase- 9, a redução das células viáveis foi significativa na dose maior de 4,0 µM, com 28, 89 ± 52%. A doxorrubicina houve diminuição de 45,00 ± 5,26% (Figura 28A). Na apoptose inicial e tardia, observou-se que apenas na maior dose da CG houve aumento significativo da apoptose, 24,07 ± 8,58% e 11,85 ± 4,62% respectivamente. Na necrose, pode-se observar aumento nas células tratadas com doxorrubicina de 25,10 ± 4,94% (Figuras 28 e 29).

Fi

gura 26: Análise da detecção da Caspase Iniciadora 8, por citometria de fluxo em células HL-60. (A) percentual de células viáveis, (B) percentual de células em apoptose incial, (C) percentual de células em apoptose tardia, (D) percentual de células em necrose. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo. A CG foi testada nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM com 24h de incubação. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguido pelo teste Student Newman-Keuls, com significância estatística (*p< 0,05, **p<0,001), no programa GraphPad Prism versão 5.0.

Viáveis Apoptose Inicial

114

Fi

gura 27: Histograma referente ao teste da Caspase Iniciadora 8. (A): 1- Controle negativo; 2- tratadas com doxorrubicina (0,5 µM) e CG nas concentrações de 1,0; 2,0 e 4,0 µM

Dans le document La force de la culture organisationnelle et son influence sur l’épuisement émotionnel (Page 37-42)