La génétique inverse

L’étude des mécanismes de la transcription et de la réplication des Mononegavirales a longtemps été une tâche difficile du fait de la nature ribonucléique du génome de ces virus. En effet, l’ARN nu des Mononegavirales n’est pas infectieux, et doit être encapsidé sous la forme d’une RNP. La polymérase virale doit également être exprimée dans la cellule (Perez, Sanchez et al. 2003; Schneider, Naegele et al. 2003). Pour étudier ces phénomènes, il est donc nécessaire d’exprimer dans la même cellule l’ARN viral, la polymérase virale ainsi que les protéines entrant dans la composition de la RNP. Les systèmes de génétique inverse développés ces dernières années pour étudier ces mécanismes ont permis d’important progrès dans la compréhension des mécanismes de réplication et de transcription des

Mononegavirales ainsi que des voies de régulation.

De façon générale, la première étape de ces études passe par le développement d’un système de minigénome ou miniréplicon. Il s’agit d’une reconstitution d’un système de réplication avec gène rapporteur. Cela consiste à exprimer sous forme d’ADNc la séquence la plus élémentaire du génome viral, c’est-à-dire celle des régions promotrices et régulatrices de la réplication virale présentes normalement aux extrémités du génome. La séquence d’un gène rapporteur est intercalée entre ces séquences. Les protéines virales indispensables à la réplication virale doivent par ailleurs être apportées par transcomplémentation, grâce à la transfection des vecteurs d’expression de ces protéines en addition au plasmide porteur du minigénome. Le système du minigénome vise à analyser les modalités de la réplication et de la transcription. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permet ensuite de passer à des systèmes d’expression du génome complet recombinant du virus à la place du minigénome.

Dans le cas du BDV la complexité de l’organisation du génome rendait la tâche encore plus ardue. D’abord, il existait une incertitude sur les extrémités génomiques du BDV. En effet, dans les cellules infectées, on retrouve à la fois un génome aux extrémités complémentaires, comme pour les autres MNV, mais aussi un génome présentant une

Figure 15 : Principe des constructions de génétique inverse utilisées pour l’étude du Bornavirus.

(A) Construction de type minigénome à gène rapporteur de la chloramphénicol acétyl transférase (CAT). Sont représentées les formes sens (S) et antisens (AS) de la construction

troncation des quatre dernières bases en 5’. Ensuite, la composition protéique précise de la RNP de Borna présentait une incertitude. Il existe en effet plusieurs isoformes de N, de P, et de L, menant à une impressionnante variété de RNP possibles. Ceci suggère que différentes formes de RNP existent, présentant des activités transcriptionnelles différentes. Non seulement la composition de la RNP, mais aussi la stoechiométrie de ses composants est impliquée dans la régulation du cycle du BDV. A la fois in vitro et in vivo, on détecte des différences dans le ratio N/P entre la phase d’infection aiguë, et la phase persistante (Watanabe, Zhong et al. 2000). De plus, des études ont montré que l’expression transitoire de P inhibait la propagation du virus de Borna dans des cellules Vero (Geib, Sauder et al. 2003).

Construction du minigénome du BDV :

Dans le cas du BDV, le miniréplicon est constitué d’un plasmide contenant une séquence d’ADNc flanquée des signaux d’initiation de transcription et de terminaison reconnus par la polymérase virale, ainsi que les régions non codantes en 5’ et 3’ retrouvées aux extrémités du génome du BDV (Perez, Sanchez et al. 2003; Schneider, Naegele et al. 2003). L’ADNc correspond à un gène rapporteur comme la CAT ou la luciférase, disposé en antisens dans le plasmide. La construction est également flanquée de signaux 5’ et 3’ de promotion et de terminaison de transcription reconnus par la polymérase cellulaire utilisée. Plusieurs systèmes de polymérase cellulaire existent. A l’issue d’une première étape de transcription, le minigénome est produit sous forme d’ARN. La nécessité d’obtenir des extrémités précises pour cet ARN détermine l’ajout de séquences d’ajustement reconnues par les ribozymes cellulaires. La réplication de cet ARN dépend ensuite du complexe polymérase viral, qui est exprimé à partir des plasmides codant chacun pour la L, la N et la P/X. L’expression transcomplémentaire des protéines N, P/X, et L est permise par la transfection de vecteurs d’expression de chacun de ces transcrits sous la dépendance d’un promoteur cellulaire donné (Figure 14).

Ce système permet d’étudier les facteurs de régulation de la transcription par la polymérase virale, grâce à l’accès à l’expression quantitative de la CAT.

Production de virus recombinants du BDV :

A la place d’un minigénome, la totalité du génome du BDV a été transformé en antigénome d’ADN plasmidique exprimé sous le contrôle de la T7-polymérase (Schneider 2005).

Figure 16 : Le cycle viral du Bornavirus

La réplication et la transcription du BDV sont nucléaires. Le site d’assemblage des virions reste à ce jour inconnu. Sur ce schéma sont représentées les protéines virales suivantes : la Nucléoprotéine N, la Phosphoprotéine P, la Polymérase L, les différentes formes de maturation de la glycoprotéine (gp84, gp43), la ribonucléoparticule (RNP).

Le plasmide ainsi généré est transfecté accompagné des 3 plasmides codant pour les protéines L, N et P (sous le contrôle d’une polymérase cellulaire) dans des cellules qui produiront le virus recombinant. Ainsi cet antigénome est transcrit en ARN antigénomique du virus puis la polymérase L procède à la réplication virale productrice d’ARN génomiques viraux et à sa transcription, exprimant de nouvelles protéines virales avec des niveaux d’expression correspondant à ceux qui sont retrouvés lors de l’infection naturelle. Les cellules productrices génèrent de nouvelles particules virales recombinantes et infectieuses qui peuvent être collectées et qui peuvent infecter les cellules cibles pour l’étude des effets de l’infection sur le phénotype cellulaire (Figure 14).