metais, tanto ligados firmemente à enzima quanto tomados da solução juntamente com o substrato, podem participar da catálise das reações. Os metais participam dos proces- sos catalíticos de três maneiras principais: ligando-se ao substrato para orientá-lo apropriadamente para a reação; mediando reações de oxidação-redução por intermédio de mudanças reversíveis no estado de oxidação do íon metálico ou estabilizando eletrostaticamente cargas negativas.
2.3.2 Fatores que influenciam na atividade enzimática
Um fator-chave que afeta a velocidade das reações enzimáticas é a concen- tração do substrato [S]. Quando o substrato é adicionado a uma enzima (E), a reação rapidamente atinge um estado estacionário no qual a velocidade pela qual o complexo ES se forma é compensada pela velocidade pela qual ES se de- compõe. Em uma concentração fixa de enzima, à medida que a concentração de substrato aumenta, a atividade do estado estacionário aumenta de maneira hiperbólica até se aproximar de uma velocidade máxima característica deno- minada de Vmáx na qual, essencialmente, toda a enzima formou um complexo com o substrato.
A concentração de substrato que resulta em uma velocidade de reação igual à metade da Vmáx é a constante de Michaelis (Km) a qual é característica para
cada enzima agindo sobre determinado substrato.
V V S K S m x m 0=
[ ]
+[ ]
Esta equação relaciona a velocidade inicial de uma reação (V0) com [S] e Vmáx por meio da constante Km. A cinética de Michaelis-Menten também é de- nominada cinética do estado estacionário.
Da mesma forma que um substrato interfere com a velocidade de uma reação enzimática, a temperatura e o pH em que a reação ocorre também influenciam.
As enzimas têm um pH (ou uma faixa de pH) ótimo no qual a atividade ca- talítica é máxima. Da mesma forma, a temperatura também pode ser um fator limitante para a atuação das enzimas. Em uma temperatura perto de 0°C a enzi- ma praticamente não apresenta nenhuma reação, ao se aumentar a temperatu- ra a reação enzimática torna-se favorecida. Entretanto, a temperatura também é um fator que pode quebrar as ligações peptídicas das proteínas tirando a en- zima de sua conformação nativa, e, portanto, sua função catalítica.
A temperatura e o pH, dessa forma, são responsáveis pela boa atuação enzimáti- ca, podendo alterar a conformação da molécula em casos de alterações bruscas, bem como podendo tornar a enzima muito mais eficiente no seu mecanismo de ação.
2.3.3 Inibidores Enzimáticos
Inibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise, diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas. Uma só enzima pode ter muitos inibi- dores e a forma como eles atuam em uma determinada enzima também pode va- riar. Uma vez que as enzimas catalisam quase todos os processos biológicos em uma célula, os inibidores enzimáticos apresentam grande importância médica.
Os inibidores enzimáticos podem ser classificados em dois grupos: os inibi- dores reversíveis e os irreversíveis.
Os inibidores irreversíveis reagem quimicamente com as enzimas, deixan- do- as inativas permanentemente.
Já os inibidores reversíveis podem ser classificados de acordo com a forma como atuam na enzima. Eles podem ser classificados como inibidores reversí- veis competitivos ou não competitivos.
Os competitivos possuem uma estrutura molecular muito semelhante à do substrato. Dessa forma, podem se ligar ao centro ativo da enzima forman- do um complexo enzima-inibidor semelhante ao complexo enzima-substrato. Entretanto, o complexo enzima-inibidor nunca formará o produto, portanto, a ação da enzima estará bloqueada, diminuindo assim a velocidade da reação.
Os não-competitivos não apresentam nenhuma semelhança estrutural com o substrato da reação que eles inibem. Na verdade, nesse tipo de inibição os inibidores atuam com ligações em radicais que não pertencem ao centro ativo da enzima. Esta ligação modifica a estrutura da enzima, afetando também a estrutura do centro ativo, não permitindo portanto que essa enzima se ligue ao seu substrato.
2.3.4 Isoenzimas
O termo isoenzima faz referência às diferentes formas moleculares (alelos) que uma determinada enzima pode apresentar, porém, reagindo sempre com o mesmo substrato, ou seja, são enzimas que diferem na sua sequencia de ami- noácidos porém apresentam funções catalíticas iguais ou semelhantes.
As isoenzimas resultam de mutações ao nível do DNA e que podem provocar diferenças significativas nas cargas iônicas das cadeias polipeptídicas e, ainda, nas suas dimensões e formas.
Segundo a União Internacional dos Bioquímicos, a definição de isoenzimas seria: “Múltiplas formas de uma enzima apresentando, entre si, diferenças na estrutura primária, determinadas geneticamente”.
As isoenzimas podem ocorrer em uma mesma espécie, em um mesmo teci- do, ou até mesmo em uma mesma célula, podendo ser expressas em organelas distintas ou variar de acordo com o estágio de desenvolvimento da célula.
As diferentes formas de isoenzimas podem ser distinguidas umas das ou- tras por propriedades bioquímicas, tais como propriedades cinéticas ou de re- gulação, qual o cofator utilizado por elas (NADH ou NADPH, por exemplo), ou na sua distribuição subcelular (solúveis ou ligadas à membrana).
A existência de isoenzimas permite o ajuste fino do metabolismo para sa- tisfazer as necessidades particulares de um determinado tecido ou determina- do estágio de desenvolvimento do organismo. Considere o exemplo da lactato desidrogenase (LDH), uma enzima com funções no metabolismo da glicose anaeróbia e síntese de glicose. A LDH foi uma das primeiras enzimas descober- tas a possuir isoenzimas. Em tecidos de vertebrados existem pelo menos cinco diferentes isoenzimas da LDH. Os seres humanos apresentam duas cadeias po- lipeptídicas isoenzimáticas para esta enzima: a isoenzima H altamente expres- sa em coração (H de heart em inglês) e a isozima M (M de muscle em inglês) en- contrada no músculo esquelético. As sequências de aminoácidos dessas duas
enzimas são 75% idênticas. A enzima funcional é tetramérica e muitas combi- nações diferentes das duas subunidades (H ou M) são possíveis de se encontrar. A isoenzima H4, encontrada no coração, tem uma maior afinidade para deter- minados substratos do que a isoenzima M4, por exemplo.
Estas diferenças no conteúdo de isoenzimas nos tecidos celulares podem ser uma importante ferramenta para diagnóstico clínico.
Voltemos ao exemplo da LDH novamente. É possível de se avaliar a época e a extensão de danos causados ao coração devido a enfarte do miocárdio (ataque cardíaco) pela avaliação da liberação de isoenzimas de LDH do coração para o sangue. Pouco tempo depois de um ataque cardíaco, o nível sanguíneo de LDH total aumenta, havendo mais isoenzima LDH2 do que a isoenzima LDH1. Após 12 horas, as quantidades de LDH1 e LDH2 são muito semelhantes, e, após 24 ho- ras há mais LDH1 do que LDH2. Essa mudança na proporção entre LDH1/LDH2, combinada com o aumento no sangue de outra enzima do coração, a creatina quinase, é uma forte evidência de um recente infarto do miocárdio.
Em geral, a distribuição das diferentes isoenzimas de uma determinada en- zima reflete, pelo menos, quatro fatores:
1. Diferentes padrões metabólicos em diferentes órgãos. Por exemplo, para a glicogênio fosforilase, as isoenzimas presentes no músculo esquelético e no fígado apresentam diferentes propriedades reguladoras, refletindo os di- ferentes papéis de quebra de glicogênio nestes dois tecidos.
2. Diferentes locais e funções metabólicas para as isoenzimas em uma
mesma célula. Por exemplo a isoenzima da isocitrato desidrogenase presente
no citoplasma e na mitocôndria, exercendo diferentes papéis em cada local. 3. Diferentes estágios de desenvolvimento em tecidos embrionários ou
fetais e em tecidos adultos. Por exemplo, o fígado fetal tem uma distribuição
característica da isoenzima LDH, que muda conforme o órgão se desenvolve na sua forma adulta. Algumas enzimas do catabolismo da glicose em células ma- lignas (cancerosas) ocorrem como sua fetal, e não como sua forma em adultos. 4. Respostas diferentes de isoenzimas para moduladores alostéricos. Esta diferença é útil para o ajuste fino de taxas metabólicas. Por exemplo, a he- xoquinase IV (glicoquinase) do fígado e as isoenzimas hexoquinase de outros tecidos diferem na sua sensibilidade à inibição por glucose-6-fosfato.