La cohorte STANISLAS

I.1.1Description générale

La cohorte STANISLAS (Suivi Temporaire Annuel Non Invasif de la Santé des Lorrains Assurés Sociaux) est une étude familiale débutée en 1993 au Centre de Médecine Préventive de Vandoeuvre-lès-Nancy avec pour objectif principal de départ, l’étude du rôle et de la contribution de facteurs génétiques et environnementaux sur les facteurs de risque cardiovasculaire [Siest et al. 1998 ; Visvikis-Siest et Siest 2008]. C’est une étude à caractère longitudinal sur dix ans, où des familles de Meurthe-et-Moselle et des Vosges ont été invitées par la Caisse primaire d’assurance maladie à venir passer un examen de santé tous les cinq ans. Lors du recrutement initial (t0, 1993-1995), les critères d’inclusion étaient les suivants : familles d’origine française (2 générations nées en France), supposées saines, exemptes de maladies aïgues et /ou chroniques et comprenant deux parents accompagnés d’au moins deux enfants biologiques de plus de 6 ans. Le premier point du recrutement a été composé de 1006 familles (4295 sujets). Lors de la deuxième visite (t1, 1998-2000), 75% des familles sont revenues (750 familles). La troisième visite (t2, 2003-2005) a vu un retour de 375 familles. Chaque participant ou le parent ou tuteur légal (pour les mineurs) a donné son consentement éclairé pour sa participation, et cette étude a été approuvée par le comité local d’éthique de Nancy.

Le recueil des données est réalisé par un personnel qualifié : -des médecins cardiologues : échographies cardiaques

-des médecins du Centre de Médecine Préventive (CMP) : établissement du développement pubertaire

-des infirmières du CMP : mesure de la pression artérielle, de la fréquence cardiaque, du tour de taille, du tour de hanches, de l’épaisseur des plis cutanés, ostéodensitométrie

-des opératrices du CMP : poids, taille, impédance

La collection des données a été réalisée au même centre avec des protocoles et procédures standardisés et contrôlés par un programme de Contrôle Qualité.

I.1.2 Questionnaires - Mode de vie

Certaines données telles que les habitudes de vie sont collectées dans des questionnaires standardisés. Lors de l’examen de santé, il a été proposé aux participants de la cohorte STANISLAS de répondre à différents questionnaires qui varient selon l’âge de l’individu (enfant, adolescent, adulte).

Les questionnaires concernent par exemple les antécédents cardiovasculaires familiaux

(coronaropathie, obésité, hyperlipidémie, hypertension artérielle, diabète), la prise de

médicaments (répertoriés par classe médicamenteuse), le système digestif, le système

circulatoire, le système respiratoire, l’appareil uro-génital, le système locomoteur, la peau et le système sensoriel ou encore l’équilibre général de l’individu (sommeil, anxiété, nervosité, vie sexuelle, psychisme..). Un questionnaire recense les loisirs et l’activité physique du participant. Selon les réponses, il a été établi une activité sédentaire, une activité physique modérée peu exigeante et une activité physique exigeante (codifiés par 1, 2, 3 respectivement). Un autre questionnaire renseigne sur les boissons consommées par le participant (quantité et fréquence journalière) : eau, vin, bière et cidre, café et thé, lait, autres boissons non alcoolisées, apéritifs, digestifs. A partir de ces réponses, un logiciel interne au CMP a permis de calculer la quantité d’alcool consommée par jour.

Un autre questionnaire concerne la consommation de tabac. Il est demandé au participant s’il est fumeur, ex-fumeur ou non fumeur. Dans le cas des fumeurs et ex-fumeurs, le nombre de cigarettes fumées par jour et le nombre d’années de tabagisme ont été enregistrés.

Concernant les enfants, il existe un questionnaire spécialisé (croissance, poids, taille…). Pour les questionnaires mentionnés, il s’agit d’auto-questionnaires ou d’interrogations par du personnel qualifié.

I.1.3 Données anthropométriques et cliniques

Différents paramètres ont été mesurés : le poids, la taille, le tour de taille et le tour de hanches. Les individus ont été habillés légèrement et sans chaussures, débout pour les mesures de la taille et du poids. Le poids a été enregistré à partir de balances électroniques (avec une précision de 200g). La taille a été mesurée avec une précision de 0.1 cm par des toises.

Le tour de taille et le tour de hanches ont été mesurés avec un mètre-ruban avec une

précision de 0.1 cm, le sujet étant en position debout, en expiration douce et légèrement habillé.

A partir de ces paramètres, ont pu être calculés deux indices morphométriques importants : l’IMC et le rapport taille/hanches. L’IMC est calculé grâce à la formule de Quetelet :

IMC= poids (kg) / [taille (m)]²

Pour minimiser les erreurs, toutes les mesures ont été réalisées par des infirmières habilitées et la fiabilité des appareils utilisés pour ces mesures a été périodiquement contrôlée tout au long de la période d’étude.

La mesure de la pression artérielle a été faite sur le bras gauche avec un sphygmomanomètre (tensiomètre à mercure) dans des conditions standards, après cinq minutes de repos, en position couchée. La valeur enregistrée a été la moyenne de trois mesures répétées.

En ce qui concerne les adolescents, les médecins ont examiné les différents stades de leur maturation pubertaire selon la classification de Tanner 1962. La puberté a été cotée du stade I (pré-pubère) au stade V (stade adulte). Les stades de Tanner sont donc la somme de deux scores allant chacun de 1 à 5. Pour les filles, les scores sont additionnés pour le développement des seins et de la pilosité pubienne et pour les garçons, pour le développement des organes génitaux externes et de la pilosité pubienne. Dans les deux cas, le score maximum est de 10 et correspond au stade adulte.

I.1.4 Impédance bioélectrique

La résistance totale du corps a été mesurée (dans une sous-population) à l’aide de l’analyseur d’impédance BIA-101 (RJL Systems, Detroit, MI, USA). Les mesures ont été réalisées à jeun, sans activité physique préalable, après avoir uriné et après une position couchée pendant 10 minutes. Les électrodes ont été placées sur la face externe/dorsale de la main droite et en regard des jonctions metacarpophalangiennes et metatarsophalangiennes. Les mesures ont été réalisées entre 8.00 et 8.30 et entre 12.00 et 12.30 a.m. Toutes les measures ont été prises en charge par la même personne qualifiée. Les équations établies par Segal et al [Segal et al. 1988] ont été utilisées pour calculer la masse maigre chez les homes et les femmes. La masse grasse a été estimée par la formule suivante :

Masse grasse (kg) = Poids (kg) – masse maigre (kg)

I.1.5 Prélèvements sanguins 1^ière, 2^ième et 3^ième visite

Le prélèvement sanguin a été effectué au niveau d’une veine antécubitale des sujets en position allongée, à jeun depuis 12 heures. Quatre tubes de type Vacutainer® (Becton Dickinson, Grenoble, France) ont été prélevés :

-1 tube sérum de 5ml (dosages biochimiques de base) -1 tube sérum de 10ml (analyses spéciales et biobanques) -1 tube EDTA de 5ml (dosages biochimiques de base)

-1 tube EDTA de 10ml (analyses spéciales, biobanques et ADN)

Les tubes secs, avec gel séparateur de sérum, ont été centrifugés à 1000g pendant 10 minutes à température ambiante. Le sérum, à partir du tube sérum de 10ml a été stocké sous forme de paillettes dans l’azote liquide à -196°C pour des dosages ultérieurs.

Les tubes EDTA ont été centrifugés à 1000g pendant 10min à température ambiante. Le buffy coat (pour l’extraction ultérieure de l’ADN) a été prélevé à l’aide d’une pipette Pasteur, fractionné en paillettes et congelé à -196°C. Le plasma a été également conservé à -196°C sous forme de paillettes.

3^ième visite

Au 3ième recrutement, 3 types de prélèvements supplémentaires ont été effectués :

-2 tubes EDTA [biobanque ARN des globules blancs mononucléaires (PBMCs-Peripheral Mononuclear Blood Cells)]

-2 tubes héparinate de sodium (biobanque protéines des PBMCs) -1 tube Paxgène (biobanque ARN du sang total)

Les tubes EDTA ont été utilisés pour séparer les PBMCs du sang total par la technique du Ficoll (Ficollpaque^TMplus, Amersham Biosciences, Orsay, France). Les PBMCs ont été stockés à -80°C dans le tampon de lyse RNA Instapure (Eurogentec, Angers, France) pour l’extraction ultérieure des ARN totaux.

Les tubes héparinate de sodium ont été utilisés pour séparer les PBMCs du sang total par la technique du Ficoll. Les protéines des PBMCs sont extraites et stockées à -80°C.

I.1.6 Dosages biologiques

Les concentrations sériques du cholestérol total, du glucose, de l’acide urique, des

déterminées enzymatiquement grâce à un automate AU 640 (Olympus Merck, Darmstadt, Allemagne).

La concentration sérique en HDL-C a été mesurée sur un automate COBAS-Mira analyser (Roche Diagnostics, Bâle, Suisse) après précipitation des lipoprotéines contenant l’ApoB (chylomicrons, VLDL et LDL) par phosphotungstate et chlorure de magnésium (méthode PTA). Le HDL-C a été mesuré dans le surnageant par la même technique enzymatique que le cholestérol total.

Les concentrations en LDL-C ont été calculées à partir de la formule de [Friedewald et al. 1972]. Ce calcul n’est possible que si les triglycérides sont inférieurs à 4g/l et en l’absence de chylomicrons.

Formule de Friedewald :

En g/l LDL-C = (cholestérol total) – (HDL-C) – TG/5 En mmol/l LDL-C = (cholestérol total) – (HDL-C) – TG/2,18

Les concentrations sériques en ApoAI, en ApoB, en haptoglobine, en orosomucoïde et en

CRP ont été dosées par immunonéphélométrie sur un automate Behring Nephelometer Analyser II ou BNII (Dade Behring, Marburg, Allemagne).

Les concentrations en ApoCIII et en ApoE ont été mesurées par immunoturbidimétrie sur un automate COBAS-Mira (Roche Diagnostics, Bâle, Suisse).

Les concentrations sériques en insuline (mesurées dans une sous-population) ont été dosées grâce à un kit de dosage d’immuno-enzymologie microparticulaire (Microparticular Enzymatic ImmunoAssay ou MEIA) sur un automate IMx (Abbott laboratories, Abbott Park, IL, USA).

Les concentrations plasmatiques de la leptine (mesurées dans une sous-population) ont été mesurées par la technique RIA (Linco Research, Saint Charles, MO, USA). Les mesures de la leptine ont été effectuées dans l’équipe INSERM, U695 à Paris, dirigée par le Docteur Fumeron Frédéric.

I.1.7 Numération des globules blancs

Le nombre de globules blancs a été mesuré sur MAXIM Analyseur (Beckman Coulter).

I.1.8 Extraction de l’ADN

L’ADN a été extrait par la méthode de ‘salting out’ [Miller et al. 1988], à partir du buffy coat congelé à -196°C. Le principe consiste à traiter uniquement le lysat cellulaire, obtenu par

action d’une protéinase (la protéinase K), combinée à celle du SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) qui conduisent à la digestion des membranes et des protéines et à l’inactivation des nucléases, puis par une solution saline de NaCl, dont l’objectif est d’éliminer les protéines dégradées par précipitation sélective. L’ADN extrait est ensuite solubilisé dans un tampon TE (Tris-EDTA).