LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE CENTRIFUGE (CPC)

Dans un premier temps, victimes probablement de la complexité de leur appareillage et des durées de séparations très longues, les CLLCC ont eu du mal à convaincre les utilisateurs. C’est l’émergence d’appareils modernes qui a offert à ces techniques un second souffle et un élan de dynamisme.

Issu du fruit des recherches du japonais Nunogaki en 1982, le Chromatographe de Partage Centrifuge (CPC) est un des appareils modernes de CLLCC à état d’équilibre hydrostatique [42]. Avec le HSCCC, le CPC est actuellement l’appareil le plus usité et l’un des plus représentatif des CLLCC modernes.

Dans ce chapitre consacré à la CPC, son principe puis l’instrumentation utilisée sont exposés. Enfin, les caractéristiques propres à la CPC et globalement aux CLLCC modernes ainsi que différentes grandeurs associées à la chromatographie liquide de partage sont définies.

II.2.1. PRINCIPE

La CPC est une technique de chromatographie liquide-liquide sans support solide (Fig. 15), basée sur les différences de partage des solutés entre deux phases liquides non miscibles préparées par mélange de 2, 3 ou plus de solvants et/ou solutions.

Figure 15 : schéma descriptif de l'appareil de Chromatographie de Partage Centrifuge (CPC à disques

« sandwichs ») utilisé au laboratoire.

FCPC

Cellules de partage phase mobile

légère phase stationnaire conduits capillaires

Rotor

Disque de partition

F

Une phase liquide est maintenue stationnaire dans la colonne (rotor) par un champ de force centrifuge constant. Ce champ de force est généré par la mise en rotation d’une colonne contenant des cellules de partage ; ces dernières étant reliées entres elles par des conduits de section inférieure à celle des cellules de partage. L’autre phase liquide dite

« mobile » est elle pompée au travers de la phase stationnaire.

Les solutés d’un mélange sont alors séparés en fonction de leurs coefficients de partage respectifs.

II.2.2. AVANTAGES

A l’image d’autres techniques de CLLCC, les principaux avantages de la CPC reposent sur l’utilisation exclusive de fluides et notamment de solvants (Tab. 2).

Tableau 2 : principaux avantages de la CPC

Caractérisques Conséquences

Pas de support solide [42] - Pas d’adsorptions irréversibles des solutés - Peu de dégradation et de dénaturation des solutés - Pas de déchets solides potentiellement contaminés - Manipulation uniquement de liquides

- Récupération intégrale de l’échantillon

Utilisation de mélange de solvants ou de fluides supercritiques [2, 3, 57, 58, 59]

- Systèmes liquides biphasiques quasi-illimités - Paramètres physicochimiques des 2 phases et

sélectivité ajustables

- Faible consommation de solvants

- Récupération de la phase stationnaire à la fin de l’expérience (par extrusion)

Technique versatile [1, 2, 56, 57]

- Plusieurs modes de développement (élution isocratique, gradient d’élution, pH-zone refining, échange d’ions…)

- Possibilité d’inverser le rôle des phases à tout instant (mode dual)

- Séparations de composés très divers (ions, composés inorganiques, composés organiques chiraux ou achiraux…)

- Finalité surtout préparative - Scale-up aisément prédictible

- Possibilité d’utilisation comme réacteur et/ou extracteur (i.e. mode d’injection continu)

II.2.3. INCONVENIENTS

L’utilisation exclusive de liquides au sein d’une machine en rotation est souvent très contraignante. En effet, cela nécessite que l’appareillage soit étanche afin d’éviter les fuites de solvants mais également que celui-ci soit robuste et hermétique pour résister à l’augmentation de la perte de charge dans la colonne en rotation.

Par ailleurs, l’injection de l’échantillon est une étape cruciale. Celle-ci impose l’emploi de systèmes de solvants solubilisant parfaitement l’échantillon. Dans le cas contraire, les analytes de l’échantillon, apparaissant sous la forme d’un précipité ou sous forme cristallisée, peuvent contaminer la pompe (surtout les clapets) ou la colonne. Il devient ensuite difficile de nettoyer entièrement l’appareillage. De plus, la désaturation du système peut également être observée lors de l’injection d’un échantillon à fort caractère tensioactif par exemple [60]; ce qui peut nuire à la mise en œuvre des expériences de CPC.

II.2.4. INSTRUMENTATION UTILISEE

Les chaînes chromatographiques utilisées en CPC et de manière générale en chromatographie à contre courant sont composées des éléments usuels d’une chaîne chromatographique préparative classique, à savoir d’une pompe, d’un injecteur (ou échantillonneur), d’une colonne chromatographique, d’un détecteur, d’un enregistreur et d’un collecteur de fractions (Fig. 16).

Figure 16 : schéma d'une chaîne de CPC.

II.2.4.1. La pompe

Tout d’abord, la CPC étant une technique essentiellement préparative, il est nécessaire de disposer d’une pompe pouvant délivrer d’importants volumes de solvants avec des pertes de charges de l’ordre de quelques dizaines de bars et parfois de plus de 100 bars, et ce en générant un minimum de pulsations. En effet, ces dernières sont néfastes à l’équilibre hydrodynamique entre les deux phases et l’on observe alors une diminution très sensible de la rétention de phase stationnaire (vide infra). De plus les pulsations générées en amont de la colonne peuvent se propager dans toute la colonne de liquide (ex. phénomène

connu sous le nom de « coups du bélier » lors de surcharges massiques) avec les dangers liés à tout phénomène ondulatoire tel que par exemple le risque de résonance et donc d’amplification du phénomène. Des expériences menées dans ce sens au laboratoire ont permis de confirmer l’intérêt de disposer d’une pompe générant le moins de pulsations possible.

Pour les appareils de laboratoires, les pompes dites « CLHP » classiques en version semi-préparative (jusqu’à 50 ml/min) sont adaptées. Pour les appareils pilotes ou industriels, plusieurs solutions sont techniquement envisageables :

une pompe à membrane industrielle (type LEWA) couplée à un amortisseur de pulsations,

deux pompes seringues montées en série afin de pouvoir délivrer le solvant de façon non limitative et continue,

une pompe industrielle à pistons adaptée en termes de débit et de perte de charge.

Par ailleurs, les pompes gradients binaires, ternaires ou quaternaires permettent d’alimenter la colonne à l’aide de plusieurs solvants ou mélange de solvants, en même temps. Cette dernière caractéristique s’avère indispensable lors d’un développement par élution graduée, pour lequel la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l’expérience.

Lors des travaux décris dans cette thèse, nous avons utilisé une pompe gradient binaire haute pression préparative à 4 voies P580HPG fournie par Dionex (Sunnyvale CA USA) (débit max. 50 ml/ min et pression max. 100 bars) (Fig. 17).

Figure 17 : pompe binaire P580HPG Dionex^® utilisée au laboratoire.

II.2.4.2. L’injecteur

L’injection de l’échantillon est une étape clé en CPC. En effet, lorsque l’échantillon est peu soluble dans le milieu d’injection ou alors trop concentré (surcharge massique ou volumique), deux phénomènes peuvent se produire :

- il peut y avoir précipitation ou cristallisation des composés au sein de la pompe et/ou de la seringue d’injection, auquel cas il est conseillé de choisir un autre mode d’injection (à l’aide d’une pompe seringue par exemple) ou de sélectionner un autre système de solvant,

- il peut y avoir désaturation du système biphasique, les propriétés physico-chimiques des composés de l’échantillon (tensioactives entre autres) conduisent irrémédiablement à l’obtention de systèmes monophasiques au sein de la colonne CPC [60] ; ces systèmes monophasiques étant impropres à la conduite d’expériences de purification.

Pour toutes ces raisons, le système de solvants biphasique doit être scrupuleusement choisi, en considérant la solubilité de l’échantillon, le volume d’injection ainsi que la concentration en analytes. Le volume d’injection et la quantité d’analytes injectable idéaux pour obtenir une bonne séparation en mode par élution sont mentionnés la plupart du temps par le fabricant (Tab. 3). Dans le cas particulier du mode par déplacement, ces gammes sont bien plus importantes. En effet, il est possible d’injecter jusqu’à 50% du volume de la colonne sans que cela nuise à la qualité de la séparation.

Tableau 3 : quelques caractéristiques des FCPC de la gamme Kromaton, d’après [61].

FCPC Kromaton^®

Nom de l’appareil FCPC50 FCPC200 FCPC1000

Capacité volumique maximale (ml)

50 200 1000

Gamme de débits (ml/min) 1- 10 5- 15 10- 30

Gamme massique idéale d’échantillon injectable (g)

0,001- 1 0,2- 5 0,5- 30

Gamme volumique idéale d’échantillon injectable (ml)

0- 1,5 0- 6 0- 30

De façon générale, l’injection de l’échantillon est réalisée manuellement à l’aide d’une vanne d’injection équipée d’une boucle d’injection alimentée par une seringue reliée à l’entrée de la colonne et la sortie de la pompe.

Au laboratoire, nous utilisons une vanne d’injection basse pression à 6 voies permettant au solvant pompé d’alimenter la colonne en traversant (mode « Inject » ou injection) ou pas (mode « Load » ou chargement) la boucle contenant l’échantillon. Cette boucle d’injection de 20 ml est en Poly-(éthylène-co-tétrafluoroéthylène) (ETFE). La vanne d’injection ainsi que la boucle ont été obtenus par Upchurch (CIL Cluzeau Sainte-Foy-La-Grande FR) (Fig. 18) [62].

Figure 18 : schéma de la vanne d'injection à 6 voies, en position chargement ("LOAD", à gauche) et injection ("INJECT", à droite), utilisée au laboratoire, d’après [62].

II.2.4.3. La colonne chromatographique

II.2.4.3.1. Les appareils disponibles sur le marché