9. L’isolation d’un nouveau catabolite dans les feuilles de
magnolia
9.1.
Préparation d’une solution non concentrée en
catabolite
Une solution aqueuse homogène est obtenue par broyage de feuilles de magnolia (150 g) avec 750 ml de tampon de désintégration constitué de phosphate de sodium 0.1 M (pH=6.8), de MeOH et d’acétone (1 :1 :1 (v/v)). Après filtration au moyen de fins morceaux de coton (gaze), centrifugation durant 10 minutes à 8000 t/min et évaporation de l’acétone et du méthanol, on obtient une solution contenant le catabolite et les restes de chlorophylle. Ceux-ci sont enlevés par extraction au dichlorométhane, livrant alors 250 ml d’une solution aqueuse non concentrée en catabolite et exempte de chlorophylle.
9.2.
Test d’oxydation en phase aqueuse
Afin de tester si cette solution contient un catabolite (composé tétrapyrrolique), 200 µl sont prélevés et placés dans un tube Eppendorf de 1 ml. 200 µl d’acide chromique 1% dans H2SO4 2 N y sont ajoutés. Après une agitation suivie de 5 minutes de
réaction, 200 µl d’éther diéthylique sont utilisés pour extraire les éventuels maléimides obtenus. La phase organique est portée sur une CCM au moyen de plusieurs pipettes capillaires, et la plaque chromatographique est éluée (mélange : CH2Cl2 :AcOEt :EtOH :AcOH (50 :10 :5 :0.5) (v/v)). Les maléimides formés sont par
la suite mis en évidence par le système chlore/benzidine déjà utilisé [98; 105]. Pour ce faire, on place la CCM durant 1 minute dans une chambre de Cl2 où ce dernier est
généré en mélangeant une solution de KMnO4 1% et d’HCl demi-concentré. La CCM
est finalement sprayée sous très forte ventilation avec un solution constituée de 300 mg de benzidine, quelques cristaux d’iode et 100 ml d’un mélange eau :méthanol 1 :1 (v/v). La présence de spots bleus indique la position des maléimides.
9.3.
Concentration de la solution de catabolite
Pour concentrer 250 ml de solution de catabolite, on fait passer la phase aqueuse à travers une cartouche RP-18 préalablement équilibrée avec 50 ml de tampon phosphate de sodium 0.1 M (pH=6.8). Le produit reste pris dans la cartouche lui conférant une couleur brun foncé. On élue ensuite le produit avec 50-70 ml de mélange constitué de tampon phosphate de sodium 0.1 M (pH=6.8) et d’acétone (1 :1 (v/v)), livrant après évaporation de l’acétone une solution concentrée en catabolite (25-35 ml). Un test d’oxydation effectué en prélevant 200 µl de cette solution concentrée montre que les maléimides sont présents en concentration plus élevée.
9.4.
Première chromatographie liquide à moyenne
performance (MPLC)
La colonne est équilibrée avec un éluant constitué de 70% de tampon phosphate de sodium 0.1 M à pH=6.8 et 30% d’acétone. A l’aide d’un injecteur, on dépose au sommet de la colonne 15 ml du mélange concentré en catabolite, puis on élue le système jusqu’à ce que la première bande foncée de produit soit entièrement sortie de la colonne en prenant garde à ce que la pression ne dépasse pas 6 bar. Après quoi, l’éluant est changé, et la chromatographie est reprise avec un mélange 58% de tampon phosphate 0.1 M (pH=6.8) et 42% d’acétone. Ce nouvel éluant fournit des fractions de 10 ml de couleur jaune ; Chacune d’entre elles est analysée au moyen du test d’oxydation en phase aqueuse afin de définir lesquelles contiennent le catabolite. Toutes les fractions positives sont rassemblées. Cette solution est à nouveau concentrée sur cartouche afin de travailler avec des volumes minimums.
136 9. L’isolation d’un nouveau catabolite dans les feuilles de magnolia
9.5.
Analyse qualitative par chromatographie à haute
performance (HPLC) des fractions récoltées
Une injection de 50 µl d’une fraction est effectuée dans l’HPLC. Colonne analytique : 4.0 mm x 250 mm.
Matériel de remplissage : RP-100-5C18 Nucleosil.
Gradient : - 6 minutes isocratique 25% acétonitrile et 75% H2O.
- en 10 minutes, l’éluant passe de 25% acétonitrile et 75% H2O à un mélange 60%
acétonitrile et 40% H2O.
- en 14 minutes, l’éluant passe de 60% acétonitrile et 40% H2O à un mélange 65%
acétonitrile et 35% H2O.
Flux d’élution : 1.0 ml/min.
Détection UV/vis : 320 nm.
Temps de rétention du catabolite : 11.3 min.
9.6.
Chromatographie par exclusion de masse
On utilise une colonne de 16 cm de long et de 10 mm de diamètre. Le gel, de marque Toyopearl, est suspendu dans un tampon TRIS 50 mM à pH=6.8. Ce tampon sera aussi utilisé comme éluant. On injecte 5 ml du concentrat obtenu après chromatographie MPLC. La détection se fait à 320 nm avec un spectrophotomètre et 3 fractions légèrement colorées sont récoltées. Un test d’oxydation effectué sur chacune d’elles a permis d’établir que la deuxième contient le catabolite recherché. Sa pureté est déterminée par HPLC.
9.7.
deuxième chromatographie liquide à moyenne
performance (MPLC)
Une deuxième MPLC est effectuée avec le même appareillage que pour la première, en injectant le même volume (15 ml) de concentrat, mais en utilisant un éluant légèrement différent, à savoir 60% de tampon phosphate 0.1 M à pH=6.8 et 40% d’acétone. Seule la partie centrale de la fraction jaune récoltée montre un test d’oxydation positif, et l’analyse de la pureté par HPLC montre un chromatogramme satisfaisant pour les mesures spectroscopiques.
9.8.
Le dessalage et la lyophilisation
Pour dessaler un échantillon, on place la substance sur une cartouche, on lave la cartouche et son contenu avec de l’eau déminéralisée, puis on élue la substance avec un mélange eau :acétone (1 :1 (v/v)). L’acétone est évaporée et la substance est lyophilisée. On obtient 4 mg d’une substance incolore (à partir de 150 g de feuilles).
9.9.
Les tentatives de clivage des sucres au moyen de
β-glycosidase
1 ml de la solution concentrée obtenue en 9.7. est placé dans un ballon avec 5 ml de tampon phosphate 0.1 M pH=6.8, auxquels sont ajoutés 10 mg de β-glycosidase d’amande. La solution est incubée durant une nuit à 37°C, puis filtrée sur un filtre millipore approprié pour l’HPLC, et la solution est analysée par HPLC.