L’indiscrimination des plaisirs

Antes de aprofundar a discussão sobre as enzimas digestivas é sensato esclarecer que todos os resultados de classificação funcional apresentados consistem em sugestões sobre a atuação dessas enzimas. As peptidases consistem em importantes enzimas digestivas que, no entanto também podem assumir outras funções, como por exemplo, relacionados à atuação lisossomal ou como ativadoras de pró-enzimas em processos fisiológicos não relacionados à digestão. Nesse sentido, estudos funcionais ou relacionados à localização celular são imprescindíveis para a caracterização de enzimas exclusivamente digestivas, secretadas no intestino médio de insetos.

Bons e raros exemplos para confirmar a função das enzimas consistem na comprovação da expressão exclusivamente intestinal utilizando anticorpos específicos contra as variantes dessas enzimas. No estudo de caracterização das catepsinas L de T. molitor (CALs) foi detectado que as variantes da CAL1 são lisossomais, enquanto a CAL3 foi verificada exclusivamente no intestino das larvas do coleóptero (Cristofoletti et al., 2005). Em outro estudo, dentre as três catepsinas D de Musca domestica, duas delas foram detectadas no intestino, enquanto uma outra variante constitui uma enzima lisossomal (Padilha et al., 2009). No entanto, na próxima seção é descrito o perfil de expressão das principais enzimas digestivas identificadas no transcriptoma de S. levis via qRT-PCR. A imunolocalização da Sl- CathL no intestino médio das larvas, descrita no capítulo 2, foi fundamental para o entendimento e validação do padrão de expressão de outras peptidases digestivas. Dessa forma, os resultados de qRT-PCR confirmam o padrão de expressão das enzimas digestivas predominantes no intestino das larvas de S. levis, além da abrupta queda da transcrição na fase pupal ao longo do desenvolvimento do inseto.

Dentre todas as sequências de peptidases identificadas no transcriptoma, 10,5% delas foram anotadas como provavelmente relacionadas a processos não digestivos (Figura 1.3A). A figura 1.3B indica que a transcrição das prováveis peptidases digestivas é predominante no intestino das larvas desse inseto, seguida das enzimas relacionadas à digestão de carboidratos (22,04%) e lipídeos (5,85%).

Figura 1.3: Gráfico de distribuição das enzimas relacionadas à digestão nas larvas de S. levis. A: dentre todas as sequências de peptidases identificadas no transcriptoma, 10,5% delas foram anotadas como provavelmente relacionadas a processos não digestivos. B: a transcrição das prováveis peptidases digestivas é predominante no intestino das larvas desse inseto, seguida das enzimas relacionadas à digestão de carboidratos (22,04%) e lipídeos (5,85%).

Considerando os ESTs que codificam prováveis proteínas acessórias (Tabela 1.1D), a maioria deles (0,79%) foi caracterizada como similares à mucina. Alguns desses transcritos são provavelmente homólogos às peritrofinas de insetos, que desempenham papéis importantes como constituintes da membrana peritrófica. Essa estrutura da membrana peritrófica é formada principalmente por uma matriz protéica de peritrofinas associadas à quitina e é importante para a divisão do lúmen do intestino médio em dois compartimentos. Essa compartimentalização é essencial para a proteção das células do epitélio e aumento da eficiência do processo digestivo (Terra, 2001; Terra e Ferreira, 2011). Em estudos anteriores foi verificada a ocorrência de um gel peritrófico no intestino médio anterior (V1 e V2) e de membrana peritrófica no intestino médio posterior (V3 e V4) em larvas de S. levis (Soares-Costa et al., 2011). No entanto, é necessário um maior esforço de sequenciamento para a obtenção das sequências completas e caracterização detalhada dessas prováveis peritrofinas.

Na tabela 1.1 é indicada a anotação das principais enzimas e proteínas digestivas, de acordo com suas funções. A divisão respeita as cores apresentadas no gráfico da figura 1.3B, de caracterização das enzimas segundo as classes das moléculas hidrolisadas. Considerando as prováveis enzimas digestivas, 67,35% delas estão relacionadas à digestão de proteínas, que se concentra na atividade

majoritária de variantes de cisteíno peptidases do tipo catepsinas L (54,29%) e catepsinas B (6,12%), além das serino peptidases similares à tripsina (4,49%). Esse padrão predominante de atuação de cisteíno peptidases e minoritária de serino peptidases é similar ao observado para as larvas de Ceutorhynchus assimilis (Girard et al., 1998a) e Baris coerulescens (Bonadé-Bottino et al., 1999), ambos besouros da família Curculionidae.

As catepsinas B, assim como as serino peptidases e também exopeptidases, apesar de não abundantes, também devem contribuir significativamente para a digestão de proteínas nas larvas desse coleóptero. A atividade dessas enzimas já havia sido previamente relatada por meio de estudos bioquímicos realizados por Soares-Costa e colaboradores (2011) utilizando proteínas purificadas e extratos protéicos do conteúdo intestinal de larvas S. levis. A partir da análise do transcriptoma também foram identificadas duas classes principais de esterases, que estão envolvidas na digestão de lipídeos, correspondentes a 5,85% do total de enzimas digestivas. Foi identificada uma grande variedade de enzimas envolvidas na digestão de carboidratos, que correspondem a 22,04% do total de enzimas digestivas. As enzimas relacionadas à degradação de parede celular como as pectinases e celulases, além de uma invertase também são marcantes no transcriptoma, por isso sua ocorrência em insetos são discutidas em detalhes nas seções seguintes.

No item E da tabela 1.1são indicadas as peptidases que foram caracterizadas como provavelmente não digestivas. Dentre elas estão as catepsinas F, e também cisteíno peptidases que não apresentaram alta similaridade com a Sl-CathL, que é uma versão comprovadamente digestiva. A catepsina D foi detectada em índices consideráveis em todos os tecidos analisados por qRT-PCR e sua transcrição não é regulada negativamente durante a fase de pupa, o que sugere sua atuação lisossomal. Por isso essa enzima foi classificada como não digestiva.

Para diferenciar as cisteíno peptidases não digestivas foi utilizado como parâmetro além da baixa similaridade com a Sl-CathL, a predição de ocorrência de sítios de N-glicosilação nas sequências protéicas. Nessas enzimas, os sítios de glicosilação são mais abundantes e indicados com maiores probabilidades de ocorrência. Apesar da utilização desse parâmetro nesse caso especial, considerando que a glicosilação pode ser fundamental para o endereçamento

lisossomal (Cuozzo et al., 1998), a predição de sítios de N-glicosilação é um tanto incerta e os sistemas de predição são treinados para poucas proteínas humanas (NetNGlyc; Gupta et al., 2004), o que dificulta a sua utilização como parâmetro de seleção.

Tabela 1.1: Anotação dos ESTs das larvas de S. levis de acordo com seu envolvimento. A: digestão de proteínas; B: digestão de carboidratos; C: digestão de lipídeos; D: proteínas acessórias; E: peptidases caracterizadas como não digestivas. Os asteriscos indicam os genes que tiveram o perfil de transcrição avaliado por qRT-PCR.

O principal cluster da catepsina B (contig 53) foi identificado nas análises de qRT-PCR como produzido essencialmente no intestino médio e com perfil de transcrição ao longo do desenvolvimento similar à Sl-CathL. Entretanto, a detecção de sítios de N-glicosilação em sua sequência de proteína deixa claro que esse

parâmetro de predição não pode ser tomado como determinante para a atuação lisossomal de cisteíno peptidases. Na tabela 1.1, os asteriscos indicam os genes que foram analisados por Real Time PCR quantitativo ao longo do desenvolvimento do inseto e também nos tecidos dissecados das larvas. Os resultados dessas análises são mostrados e discutidos na próxima seção.