L’implication des érythrocytes de patients diabétiques dans l’HIP

3.2 Diabète, néo vascularisation, hémorragie intraplaque (HIP)

3.2.2 L’hémorragie intraplaque (HIP)

3.2.2.1 L’implication des érythrocytes de patients diabétiques dans l’HIP

Dans la pathologie diabétique, le globule rouge subit des modifications notamment à cause de sa longue durée de vie et de l’hyperglycémie du patient. Ainsi, il subit la glycation de ses protéines qu’elles soient de surfaces ou cytosoliques. La glycation la plus connue du globule rouge est celle de la chaine A de l’hémoglobine, l’hémoglobine A1c [221], qui sert d’ailleurs de marqueur pour le suivi de la glycémie des patients sur plusieurs mois. De plus, Nagai et al.

a montré que la glycation in vitro des globules rouges entraîne la formation d’AGE à leur surface et plus particulièrement de carboxyméthylysines et carboxyéthylysines [222].

Cependant, les érythrocytes subissent d’autres modifications chez le diabétique. Ils deviennent plus rigides, externalisent leur phosphatidylsérines (PS), voient leur forme changer avec une surface irrégulière [223] et ont aussi une durée de vie réduite (80 jours ± 10 jours) par rapport aux érythrocytes des patients non diabétiques (120 jours). Enfin, il faut noter que l’adhérence des globules rouges diabétiques à l’endothélium est accrue [223]. De plus, des travaux ont montré que l’interaction entre les cellules endothéliales et des érythrocytes diabétiques passe notamment par la liaison des AGE à leurs récepteurs RAGE (AGE receptor) à la surface des cellules endothéliales [22, 224, 225]. De ce fait, on peut supposer que cette interaction prolongée érythrocytes/cellules endothéliales chez les patients diabétiques participe à l’athérogènese. D’ailleurs, lors d’hémorragies intraplaque, l’extravasation des érythrocytes dans la plaque participe à sa déstabilisation en étant un pourvoyeur de lipides (cholestérol) et d’éléments pro-oxydants (hémoglobine, hème et fer), phénomène qui pourrait être amplifié chez les diabétiques.

69 3.2.2.2 La clairance des globules rouges : rôle de l’haptoglobine dans la plaque du diabétique.

Chez les sujets non diabétiques, la clairance de l’hémoglobine libre dans la plaque est assurée par l’haptoglobine (Hp). Cette protéine va former un complexe avec l’hémoglobine, le complexe Hp-Hb, qui sera reconnu par le récepteur CD163 à la surface des macrophages. Ainsi, les complexes Hp-Hb sont internalisés par les macrophages, l’hémoglobine est ensuite libérée et dégradée par HO-1 [226]. Plusieurs études ont exploré l’impact du diabète de type 2 et des différents génotypes de l’Hp sur les dommages engendrés par la libération de l’hémoglobine dans l’athérosclérose. Chez le patient diabétique, l’affinité du complexe Hp2-2/Hb pour le récepteur CD163 à la surface des macrophages est plus forte que celle du complexe Hp1-1/Hb.

Le complexe Hp1-1/Hb est internalisé par les macrophages plus rapidement que le complexe Hp2-2/Hb. De cette manière, le temps de demi-vie du complexe Hp2-2/Hb est plus long (50 min) que celui du complexe Hp1-1/Hb. De plus, la capacité antioxydante de l’Hp en ce qui concerne la séquestration de l’Hb et la stabilisation de l’hème et du fer est diminuée lorsque l’Hp2-2 est liée à l’hémoglobine glyquée (HbA1c), ce qui pourrait favoriser la peroxydation des lipides environnants [126]. De plus, les travaux d’Asleh et al. mettent en évidence que le complexe Hp2-2/Hb se lie de manière plus importante aux HDL (lipoprotéines de haute densité) que le complexe Hp1-1/Hb. De cette façon, l’Hb liée à l’Hp2-2 pourrait oxyder de manière plus importante les lipides des HDL par rapport au complexe Hp1-1/Hb, ce qui altère alors la fonction de transport inverse du cholestérol des HDL [130]. De plus, dans ces études, chez les patients diabétiques ayant le génotype Hp2-2 on constate une diminution du taux de macrophages qui expriment CD163 à leur surface. Ce résultat a d’ailleurs été montré aussi sur un modèle de macrophages humains (THP1) stimulés en conditions hyperglycémiques où on remarque que l’hyperglycémie diminue l’expression de CD163 à la surface des macrophages [129]. Le taux de macrophages présentant à leur surface le récepteur CD163 diminue également dans les plaques d’athérosclérose des patients diabétiques et cette diminution est plus marquée chez les patients diabétiques Hp2-2 par rapport aux patients diabétiques Hp1-1 ou Hp2-Hp1-1. Cependant, la forme soluble du CDHp1-163 (sCDHp1-163) est plus élevée chez les patients diabétiques Hp2-2 par rapports aux patients Hp1-1 et Hp2-1 [129]. De surcroît, la densité de néo vaisseaux et de cellules musculaires lisses au niveau de la plaque des patients diabétiques Hp2-2 est supérieure à celle des plaques des patients diabétiques Hp1-1 ou Hp2-1. Cela pourrait amplifier l’hémorragie [227] et ainsi augmenter la proportion de fer libre dans les

70 plaques de ces patients [228]. Par ailleurs, la proportion de fer retrouvée dans les plaques des patients diabétiques Hp2-2 est 4 fois supérieure à celle des patients diabétiques Hp1-1 ou Hp2-1. Suite à l’augmentation de l’hémorragie intraplaque des patients diabétiques Hp2-2, l’expression génique et protéique de HO-1 et de la myéloperoxydase (MPO) sont augmentée par rapport aux plaques des patients diabétiques Hp1-1 et Hp2-1. De même, l’inflammation est plus élevée dans les plaques des patients diabétiques Hp2-2 par rapport aux plaques des patients diabétiques Hp1-1 ou Hp2-1 [227]. Dans cette étude, Purushothaman et al. montrent alors que le génotype Hp2-2 des patients diabétiques altère la clairance de l’hémoglobine et augmente le stress oxydatif ainsi que l’inflammation au niveau de la plaque d’athérosclérose de ces patients. En outre, des études cliniques ont montré que le génotype d’Hp des patients diabétiques est un facteur de risques cardiovasculaire. En effet, le génotype Hp2-2 des patients diabétiques augmente les risques de complications cardiovasculaires comme montré dans les quelques exemples d’études suivantes : l’étude sur la population indienne américaine

« Strong Heart » [229], l’étude « Munich Stent » [230], l’étude « ICARE » [231] ou encore l’étude « Epidemiology of Diabetes Complication (EDC) Study of Childhood onset type 1 diabetes » [232, 233].

3.2.2.3 La NETose chez le diabétique et l’HIP.

La formation des NETs est dépendante du glucose, les besoins métaboliques de la NETose requièrent d’abord du glucose exogène pour la décondensation de la chromatine puis dépendent du glucose exogène associé à la glycolyse pour la libération des complexes NETs [234]. Ainsi, chez les patients diabétiques l’hyperglycémie participe à la formation des NETs.

Les travaux de Menegazzo et al. montrent que l’hyperglycémie entraîne la formation des NETs in vitro et in vivo chez les patients diabétiques. Ils montrent aussi que le taux NETs et d’élastase circulants libérés par les neutrophiles est corrélé aux taux de glycation de l’hémoglobine des patients diabétiques de type 2 [235]. De plus, la NETose est associée à l’hyperglycémie, participe aussi à altérer la réparation de la peau chez les souris diabétiques comme exposé dans les travaux de Wong et al. [236]. Il y a très peu de données sur la participation des marqueurs de la NETose (complexes NETs, MMP, MPO ou élastase) à la déstabilisation de la plaque d’athérosclérose des patients diabétiques. Cependant, comme ces acteurs participent

71 déjà à la déstabilisation de la plaque des patients non diabétiques, on peut supposer qu’ils interviennent aussi dans les plaques des patients diabétiques de manière plus marquée.

Objectifs de travail

75 Dans la pathologie de l’athérosclérose, l’hémorragie intraplaque représente un facteur important de complication et de déstabilisation de la plaque d’athérothrombose. Chez le diabétique de type 2, l’angiogenèse intraplaque est augmentée à l’intérieur des plaques, ce qui provoque des hémorragies ce qui favorise la rupture de la plaque [214, 237]. En effet, ces néo vaisseaux immatures, fragiles et perméables apportent des composants sanguins au sein de la plaque. Ainsi, l’extravasation des globules rouges et des leucocytes, dont les neutrophiles, représente un des facteurs ayant un rôle déterminant dans la rupture de la plaque. D’ailleurs, l’activation des neutrophiles représente un facteur important de vulnérabilité [72]. La libération de protéases, comme l’élastase ou les MMP, va entraîner la diminution de l’épaisseur de la chape fibreuse qui protège le cœur nécrotico-lipidique. D’autre part, la libération d’enzymes pro-oxydantes telles que la MPO va perturber d’avantage la balance redox de la plaque et d’autant plus fragiliser la plaque. Enfin, l’expulsion de l’ADN des neutrophiles, sous forme de filaments appelés NETs complexés avec ses protéases granulaires et les histones, va avoir une action bactéricide et surtout une activité pro-coagulante [238].

L’activation des neutrophiles participe donc activement à la déstabilisation de la plaque. De plus, l’environnement hyper glycémique chez le diabétique de type 2 entraîne la glycation des protéines aboutissant à la formation d’AGE, qui à leur tour favorisent l’activation des neutrophiles par un phénomène de pré-activation (priming) [239].

Lors de l’hémorragie intraplaque, l’apport chronique et la stagnation des globules rouges contribuent à l’expansion de la plaque de diverses façons, grâce notamment à leur membrane plasmique riche en cholestérol ou encore grâce à la libération de leur contenu (hémoglobine contenant notamment du fer) qui contribuent au stress oxydant au sein de la plaque [71, 240].

La clairance de ces divers éléments se fait via différents acteurs. En premier lieu, les macrophages phagocytent les globules rouges lysés ou sénescents via les signaux « eat-me » présents à leur surface, mais sont aussi capables d’éliminer les complexes hémoglobine-haptoglobine (Hb-Hp) qu’ils captent via les récepteurs CD163 à leur surface [241]. En second lieu, d’autres types cellulaires participent aussi à la clairance des globules rouges résident dans la plaque comme les cellules musculaires lisses [242]. Cependant, le premier type cellulaire en contact avec les globules rouges au niveau des néo vaisseaux immatures, fragiles et perméables sont les cellules endothéliales. Ces dernières pourraient aussi internaliser/phagocyter les globules rouges résident au sein de la plaque participant ainsi à l’expansion et à la déstabilisation de cette dernière. Il a d’ailleurs été montré que chez les

76 patients diabétiques de type 2, les modifications dues à la glycation et au stress oxydant rendent l’endothélium prothrombotique et induisent une augmentation de l’adhésion des plaquettes mais surtout des globules rouges [225].

Le premier objectif de mon travail de thèse était d’identifier les biomarqueurs pouvant être associés à des plaques d’athérothrombose vulnérables chez les diabétiques. Ainsi, l’évaluation des concentrations des marqueurs biochimiques acteurs de la déstabilisation de la plaque d’athérothrombose tels que les marqueurs de l’activation des neutrophiles (via la libération des protéases granulaires, de l’ADN libre ou sous forme de complexes NETs et d’enzymes pro oxydantes) et les marqueurs de l’hémorragie intraplaque (via la présence de globules rouges, d’hémoglobine, des récepteurs solubles des complexes Hb-Hp sCD163) a été réalisée dans le cadre d’une étude clinique sur l’île de La Réunion en partenariat avec le Centre Hospitalo-Universitaire (CHU) et la Clinique Sainte Clotilde (groupe Clinifutur).

Le deuxième objectif de cette thèse était d’évaluer dans un contexte mimant un diabète de type 2, les réactions engendrées par des globules rouges glyqués sur l’endothélium avec lequel ces cellules sont en contact dans la plaque d’athérosclérose. Pour cela, l’étude de l’impact des globules rouges diabétiques sur l’endothélium a été réalisée in vitro sur une lignée de cellules endothéliales humaines, les EA.hy926. En premier lieu, un modèle de glycation des érythrocytes in vitro a été mis au point puis caractérisé. En second lieu, ces érythrocytes glyqués ont été mis en contact avec les EA.hy926 afin d’explorer la capacité des cellules endothéliales à interagir avec les érythrocytes, leurs réactions en termes de réponse antioxydante et de fonctionnalité.

Démarche expérimentale,

Résultats et Discussion

79 Afin de répondre aux objectifs décrits, nous avons adopté la méthodologie suivante : nous avons d’abord participé activement au déroulement d’une étude clinique visant à évaluer les marqueurs de la vulnérabilité de la plaque d’athérothrombose carotidienne chez le diabétique et nous avons ensuite réalisé une étude in vitro sur l’impact des globules rouges diabétiques sur l’endothélium.

4 Etude clinique : Marqueurs d’Athérothrombose carotidienne Chez le Diabétique – MADi

Comme décrit précédemment, la prévalence du diabète de type 2 sur l’île de La Réunion est supérieure à celle de la France hexagonale et la mortalité engendrée par cette pathologie est aussi 3,5 fois supérieure [2]. Parmi les complications qui en résultent, les maladies cardiovasculaires touchent 60% des patients diabétiques de type 2 [3]. Ces maladies se traduisent par des accidents coronaires ou cérébraux suite au développement de lésions athérosclérotiques dans les zones privilégiées que sont les artères coronaires, carotides ou cérébrales. Suite à des études de populations, une augmentation de la prévalence des AVC chez les diabétiques de type 2 a été montrée. D’ailleurs, sur l’île de La Réunion, les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité contrairement à la France hexagonale où le cancer remporte la première place [5]. Cela peut s’expliquer ici par l’augmentation des facteurs de risques que sont entre autre l’hypertension artérielle, le diabète de type 2 ou encore les dyslipidémies, 1 cas sur 4 à La Réunion contre 1 cas sur 10 en France hexagonale [5].

Les plaques des patients diabétiques se développent plus rapidement que celles des patients non diabétiques. De plus, le niveau de complications, le taux d’hémorragies intraplaque et de néo vaisseaux sont accrus chez les diabétiques [214]. L’hémorragie intraplaque conduit à l’extravasation des composés sanguins dans la plaque et rend cette dernière vulnérable [237].

De surcroît, la présence d’AGE au sein de la plaque participe au stress oxydant qui y règne via la stimulation d’enzymes capables de produire des espèces réactives de l’oxygène comme la NADPH oxydase. De plus, l’étude de Rangé et al. a mis en évidence l’existence d’une corrélation entre l’hémorragie intraplaque, l’activation des neutrophiles et la concentration

80 du LPS bactérien dans les plaques d’endartériectomies carotidienne humaines [243].

D’ailleurs, dans cette étude la bactérie Tannerella forsythia a été identifiée dans les plaques carotidiennes. Par ailleurs, il a été montré que les parodontites sont associées au risque de développer des maladies cardiovasculaires chez le diabétique [34]. De ce fait, la présence de la bactérie Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), l’un des agents infectieux responsable de parodontites, pourrait participer via le stress qu’elle engendre à entretenir l’activation des neutrophiles et la libération des enzymes granulaires [72].

En plus de l’activation des neutrophiles provenant de l’hémorragie intraplaque, les saignements apportent également de nombreux érythrocytes. Ces derniers stagnent dans la plaque et subissent une lyse ou éryptose (mort cellulaire par apoptose des érythrocytes) entraînant la libération de leur contenu (cholestérol membranaire, fer, hémoglobine, hème,

…) au cœur de la plaque participant ainsi à sa déstabilisation. Il existe des moyens de clairance de ces éléments, notamment par les macrophages qui expriment à leur surface des récepteurs CD163 capables de se lier aux complexes Hb-Hp afin de les éliminer. Ces récepteurs peuvent d’ailleurs être présents dans la plaque sous forme soluble (sCD163), suite à un clivage protéolytique notamment par l’élastase [244].

4.1 Objectifs de l’étude

Les divers acteurs cités ci-dessus participent activement à la déstabilisation de la plaque d’athérosclérose. Ici, nous faisons l’hypothèse qu’il existe des différences entre les plaques d’athérosclérose des patients diabétiques de type 2 par rapport aux patients non diabétiques.

Le but de l’étude clinique est donc de doser les marqueurs cités précédemment qu’ils soient circulants ou libérés par les plaques d’athérothrombose des patients issues d’endartériectomies carotidiennes, puis de comparer les profils de sécrétion entre les plaques provenant de patients diabétiques versus non diabétiques.

Nous avons recueilli le plasma, le sérum et les pièces d’endartériectomie carotidienne des patients inclus dans l’étude par les trois centres participants à la recherche, les CHU nord et sud (centres d’inclusions 01 et 02) de La Réunion et la clinique Sainte Clotilde (centre d’inclusion 03). Les pièces d’endartériectomies carotidiennes ont été incubées durant 24h dans du milieu de culture sans sérum, mais contenant des antibiotiques et antifongiques afin qu’elles puissent libérer les différents marqueurs qu’elles contiennent (Figure 17).

81 Dans un premier temps, nous avons réalisé le dosage de l’ADN libre dans le plasma et de celui libéré par les plaques des patients incubées. Dans un second temps, nous avons dosé sur ces mêmes échantillons les éléments suivants :

 Les marqueurs de l’activation des neutrophiles : les complexes ADN/MPO (NETs), les complexes élastase/anti-élastase, la NGAL (protéine chaperonne associée à la MMP9) et la MPO.

 Les marqueurs de l’hémorragie intraplaque : l’hémoglobine libérée par les plaques et le récepteur soluble sCD163.

 Les marqueurs de stress oxydant et de glycation : l’albumine glyquée, les fructosamines, les protéines carbonylées, les AGE totaux.

 la présence de bactéries parodontales comme P. gingivalis en dosant la présence d’anticorps anti-P. gingivalis

Figure 17 : Schéma général de l’étude clinique.

Des échantillons sanguins ainsi que les pièces d’endartériectomies carotidiennes sont prélevés sur les patients participants à l’étude. Les échantillons sanguins permettent l’isolement du plasma et du sérum des patients dans le but d’évaluer les concentrations circulantes des marqueurs cités précédemment. Les pièces d’endartériectomies carotidiennes sont disséquées et la partie responsable de la sténose (CP) est séparée de la partie non responsable de la sténose (NCP). Ces tissus sont ensuite incubés pendant 24h dans du milieu de culture puis les marqueurs cités précédemment sont quantifiés dans ces milieux conditionnés.

4.2 Inclusion des patients

Par rapport aux activités des centres d’inclusion, les CHU nord – sud et la clinique Sainte Clotilde, il était prévu d’inclure un minimum de 100 patients avec une équivalence entre le nombre de patients diabétiques de type 2 et le nombre de patients non diabétiques sur une durée de 2 ans.

a) Critères d’inclusion des patients

Les patients qui ont été inclus dans l’étude devaient subir une intervention d’endartériectomie carotidienne et répondre aux critères suivants :

- être âgés de plus de 18 ans au moment de l’intervention, - être affilié à un régime de sécurité sociale,

- avoir signé un consentement éclairé,

Le groupe des patients diabétiques a été défini comme suit : soit par la prise de traitements antidiabétiques oraux ou injectables, soit par le relevé d’une glycémie à jeun > 7 mmol/L ou d’un taux d’hémoglobine glyquée (HbA1c) ≥ 6,5%. Seuls les patients diabétiques de type 2 définis selon les critères de l’étude ENTRED ont été retenus : soit un diabète non traité par insuline, soit traité mais diagnostiqué après 45 ans ou diagnostiqué avant 45 ans avec un délai de mise sous insuline > 2 ans après le début de la maladie.

(http://www.invs.sante.fr/surveillance/diabete/entred_2007_2010/methodologie.htm) Le groupe des non diabétiques (sujets contrôles) a été défini comme tel : diabète non connu ou non traité par antidiabétiques et une glycémie à jeun < 7 mmol/L.

b) Critères de non inclusion des patients

Tous les patients présentant les critères suivant ont été exclus de l’étude :

- Grossesse en cours,

- Antécédents de maladie auto-immune,

- Antécédents de maladie inflammatoire chronique,

83 - Antécédents de néoplasie,

- Sujet diabétique de type 1 défini de la manière suivante : sujet de moins de 45 ans traité d’emblée par insuline ou si sujet de plus de 45 ans avec un délai de mise sous insuline < 2 ans.

4.3 Déroulé de la recherche

La recherche s’est déroulée en plusieurs temps. La première étape concerne et implique le patient directement. Je suis intervenue lors des étapes de recueil des échantillons biologiques (sang, plasma, sérum et pièce chirurgicale), de recueil des données biologiques afin de remplir les cahiers de données des patients de l’étude et j’ai réalisé les dosages des marqueurs énumérés précédemment.

• Le parcours des patients inclus dans l’étude.

Tous les patients ayant une indication pour une endartériectomie carotidienne par voie chirurgicale ont suivi le parcours suivant :

- Une visite de pré-inclusion au cours de laquelle les médecins investigateurs les ont informés de l’étude clinique. Les risques potentiels ainsi que les attentes suite à leur participation leur ont été expliqués. Les médecins étaient à disposition des patients pour répondre à leurs interrogations au cours de cette visite. Un consentement éclairé a été remis aux patients lors de cette visite. Les patients ayant consentis à faire partie de l’étude ont remis leur consentement éclairé signé aux médecins. L’intervention a ensuite été planifiée.

- La visite d’inclusion précède le jour de l’intervention, le patient a été admis au centre hospitalier. Des prélèvements sanguins ont été effectués par les infirmiers, une partie de ces prélèvements ont servi pour les dosages biologiques de routine (numération formule sanguine, dosage de la CRP ultra-sensible, de l’hémoglobine glyquée, de la glycémie et un bilan lipidique) et l’autre partie de ces prélèvements a été acheminée

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