L’effet des hautes températures sur la structure des hémocyanines de L. polyphemus et

hémocyanines de L. polyphemus et E. californicum

Nous nous sommes intéressés dans cette partie à examiner la stabilité des deux hémocyanines de L. polyphemus et E. californicum sous l’effet des hautes températures allant de 15 à 75°C. Des spectres d’absorption infrarouge ont été mesurés à 15, 25, 35, 45, 55, 65 et 75°C en solution à différentes valeurs de pD (7, 7.5-7.8 et 8.5) (Figure S6 en annexe) en utilisant la cellule de transmission décrite précédemment dans la partie 1.6 de Matériels et Méthodes. La plage de température étudiée monte jusqu’à 75°C, ces protéines peuvent être étudiées à de si haute température en raison de leur stabilité. En effet Ikadieva et al et Sterner et al ont montré que l’extrême thermostabilité de ces hémocyanines est liée à la stabilité intrinsèque élevée de leurs sous-unités. Des mesures en calorimétrie différentielle à balayage (DSC) sur les hémocyanines de L. polyphemus et E. californicum ont présenté des températures de transition de 93 et 92 °C respectivement.8, 16

Des études précédentes ont montré que la fonction de l’hémocyanine est conservée malgré les variations de pH provenant de l’effet des hautes températures. En effet, Sterner et al ont observé par diffusion de la lumière que la diminution du pH de 7.6 à 6.2 dans la gamme de température allant de 20 à 85°C n’est pas accompagnée d’une dénaturation de l’hémocyanine de l’E.

californicum.8 De plus Decker et al, ont démontré via des mesures d’ultracentrifugation analytique que l’hémocyanine de l’E. californicum conserve sa coopérativité à l’oxygène dans la gamme de pH comprise entre 5 et 9. 17 Ainsi, les résultats de nos expériences dédiées à l’étude des hémocyanines sous l’effet des hautes températures à différents pD pourront être expliqués par les variations de températures.

La déconvolution de la bande amide I des hémocyanines de L. polyphemus et E. californicum à 15 et 75°C à pD 7, 7.5-7.8 et 8.5 est représentée sur la Figure 7 et la Figure 8, respectivement.

131 Figure 7 : Déconvolution de la bande amide I en 6 composantes de profil Gaussien de l’hémocyanine de L.

132 Figure 8 : Déconvolution de la de la bande amide I en 6 composantes de profil Gaussien de l’hémocyanine de

133 Le Tableau 5 détaille les différents éléments de la structure secondaire des deux hémocyanines à 15 et 75°C à différents pD. Structure secondaire (%) Hémocyanines pD 8.5 pD 7.5-7.8 pD 7 15°C 75°C 15°C 75°C 15°C 75°C Hélices α L.polyphemus 34 35 32 29 34 33 E.californicum 37 36 33 36 36 33 Feuillets- parallèles L.polyphemus 28 27 27 26 27 30 E.californicum 31 29 28 27 31 30 Feuillets- antiparallèles L.polyphemus 9 9 10 7 9 4 E.californicum 5 3 7 5 8 5 -coudes L.polyphemus 9 10 11 17 9 13 E.californicum 6 11 16 16 9 14 Structure désordonnées L.polyphemus 20 19 20 21 21 20 E.californicum 21 21 16 16 16 18

Tableau 5 : Pourcentages des structures secondaires des hémocyanines de L. polyphemus et E. californicum en solution à pD 7, 7.5-7.8 et 8.5 obtenus à l'aide de la déconvolution de la bande amide I en six composantes (1688, 1674, 1658, 1646, 1635 et 1617 cm-1). La précision de la distribution des différentes composantes est

estimée à ± 3.5%.

Les résultats obtenus ont montré que les deux structures secondaires majoritaires des deux hémocyanines en solution à différents pD (7, 7.5-7.8 et 8.5) à 15 et 75°C sont les hélices α (33-37%) et les feuillets  parallèles (26-31%). De plus, le taux des différents éléments de structure secondaire des hémocyanines de L. polyphemus et E. californicum est resté stable sous l’effet des hautes températures ce qui indique une haute thermostabilité de ces protéines.

134

4 L’effet de l’oxygénation sur la structure secondaire des

hémocyanines de L. polyphemus, E. californicum et A.

leptodactylus à différents pH

Le deuxième point qui sera développé dans cette partie est l’oxygénation. Au cours de cette étude, nous avons suivi par spectroscopie infrarouge en mode ATR la stabilité des trois hémocyanines de L. polyphemus, E. californicum et A. leptodactylus à pH 7, 7.5-7.8 et 8.5 en présence et absence d’oxygène afin d’examiner les changements induits sur la structure secondaire de ces protéines. Les spectres ATR-FTIR ont été enregistrés dans la gamme spectrale allant de 1750 à 1450 cm-1 et en Figure 9 sont présentées les régions correspondant aux modes amide I et amide II.

135 Figure 9 : Spectres ATR-FTIR des hémocyanines de L. polyphemus, E. californicum et A. leptodactylus à

différents pH et différents états d’oxygénation.

Au cours de ce projet, nous nous sommes focalisés uniquement sur l’étude de la bande amide I qui est attribuée aux vibrations d’élongations (C=O) de la chaîne polypeptidique et est spécifique de la structure secondaire de la protéine. Ainsi, cette bande sera utilisée pour suivre les changements conformationnels en fonction de l’état d’oxygénation.

136 La bande amide II située aux alentours de 1535 cm-1 est décalée de 20 cm-1 vers les faibles nombres d’onde lors de la désoxygénation. En effet, cette bande est sensible aux changements qui se produisent au niveau de la structure secondaire.

La comparaison du profil de la bande amide I obtenue à différents états d’oxygénation et de pH pour les trois hémocyanines a montré des changements bien distincts notamment à l’état désoxygénée (Figure 9 spectres rouges). En effet, la bande amide I centrée aux alentours de 1647 cm-1 a le même profil spectral à l’état oxygéné et réoxygéné à toutes les valeurs de pH étudiées (spectres noirs et bleus). Cependant, la bande amide I de la forme désoxygénée de ces trois protéines est observée aux alentours de 1650 cm-1. De plus, les éléments de la structure secondaire obtenus par la déconvolution de la bande amide I sont également déplacés vers des fréquences plus élevées en allant vers un pH basique. Pour quantifier les changements de la structure secondaire liés à la présence et l’absence d’oxygène à différentes valeurs de pH, la décomposition de la bande amide I en cinq bandes situées à 1687, 1669, 1648, 1628 et 1613 cm-1 a été réalisée. Les Figure 10, Figure 11 et Figure 12 détaillent l’évolution des différents éléments de la structure secondaire des trois hémocyanines de L. polyphemus, E. californicum et A. leptodactylus à différents états d’oxygénation et de pH (Tableau S7 en annexe).

137 Figure 10: Histogrammes présentant la variation des éléments de la structure secondaire de l’hémocyanine de L.

polyphemus en fonction de l'état d'oxygénation à pH 7,7.5 et 8.5. La précision de la distribution des différentes

138 Figure 11: Histogrammes présentant la variation des éléments de la structure secondaire de l’hémocyanine de

l’E. californicum en fonction de l'état d'oxygénation à pH 7, 7.8 et 8.5. La précision de la distribution des différentes composantes est estimée à ± 3.5%.

139 Figure 12: Histogrammes présentant la variation des éléments de la structure secondaire de l’hémocyanine de

l’A. leptodactylus en fonction de l'état d'oxygénation à pH 7,7.5 et 8.5. La précision de la distribution des différentes composantes est estimée à ± 3.5%.

Les trois hémocyanines à l’état oxygéné sont principalement structurées en hélices α plus structures désordonnées (37-52%) pour toutes les valeurs de pH étudiées. La comparaison de la structure secondaire de ces trois hémocyanines a révélé des changements conformationnels différents à l’état désoxygéné aux trois valeurs de pH étudiées. Des comportements différents sont observés pour les structures feuillets β parallèles, β coudes et les feuillets β antiparallèles en fonction du pH et de l’état d’oxygénation. Par conséquent, pour simplifier l’interprétation des résultats, nous avons additionné toutes les composantes β pour discuter des changements structuraux en fonction de deux structures principales : l’hélice α plus structures désordonnées et la structure β totale. En effet, la désoxygénation de ces trois hémocyanines induit une légère diminution des hélices α plus structures désordonnées (30-42%) et l’augmentation de la structure totale β (+ 4-11%) à tous les pH étudiés (Tableau S7 en annexe). Ce changement conformationnel sur la structure des trois hémocyanines est plus prononcé à pH 7 et 7.5 pour L.

140 structuraux observés sont similaires à toutes les valeurs de pH étudiées. Ces changements conformationnels, induits pour les trois hémocyanines à l’état désoxygéné peuvent être appuyé par d’autre études effectuées sur l’hémocyanine E. californicum à l’état désoxygéné.

En effet, des études réalisées par diffraction des rayons X sur le site actif de l’hémocyanine à l’état désoxygéné ont montré que la géométrie de ce site change avec la désoxygénation en fonction du pH. Cela est suggéré comme le résultat d’une contrainte sur le site actif induit par des changements conformationnels au niveau de la protéine.18

De plus, d’autres études par diffraction des rayons X aux petits angles ont montré que la forme oxygénée de l’hémocyanine de l’E.californicum était beaucoup moins compact qu’à l’état désoxygéné, ce qui peut indiquer des changements au niveau de la structure quaternaire de la protéine. 19

Les résultats des taux de structures secondaires des trois hémocyanines à l’état réoxygénée sont presque identiques à ceux obtenus pour les protéines à l’état oxygéné pour les différentes valeurs de pH étudiées (Figure 10, Figure 11 et Figure 12 et Tableau S7 en annexe).

141