L’autorégulation de la mycorhization par la plante a été démontrée par un certain nombre de travaux, notamment grâce à des cultures de plantes entières dont le système racinaire est divisé en deux parties. Différentes conditions ou traitements appliqués dans l’un des compartiments racinaires, affectent le taux de mycorhization dans le second par l’intermédiaire de signaux systémiques non identifiés à ce jour (Catford et al., 2003; Staehelin et al., 2011a).
1.2.3.6.1. Les CLE peptides
On mentionnera ici l’identification de signaux de régulation appartenant à la famille des CLE peptides (Oka-Kira et Kawaguchi, 2006; Magori et Kawaguchi, 2009; Mortier et al., 2010). Ces peptides initialement découverts chez l’animal (Jun et al., 2008), régulent le développement cellulaire des plantes (Wang et Fiers, 2010; Katsir et al., 2011). La plupart des mutants affectés dans l’autorégulation de la symbiose rhizobienne le sont également dans la symbiose mycorhizienne, suggérant une similitude dans les mécanismes de régulation (Staehelin et al., 2011b). Par conséquent, Il semble très probable que les CLE peptides soient aussi impliqués dans l’autorégulation de la symbiose mycorhizienne (Staehelin et al., 2011a).
1.2.3.6.2. Le phosphate
28 mycorhization (Smith & Read, 2008). Les mécanismes de cette régulation négative par le phosphate sont encore mal connus mais ils pourraient agir très tôt et impliquer des signaux systémiques provenant des parties aériennes de la plante (Breuillin et al., 2010 ; Balzergue et al., 2011). Par ailleurs, le phosphate fourni par le champignon MA est essentiel au maintien des structures symbiotiques et au développement de la mycorhization (Javot et al., 2007). Enfin les concentrations en phosphate dans le milieu et in planta influencent la production de strigolactones dont on sait le rôle stimulateur sur les champignons MA (Yoneyama et al., 2007; Lopez- Raez et al., 2011). On peut donc faire l’hypothèse que le phosphate agit comme un signal de régulation de la symbiose (Yang et Paszkowski, 2011).
1.3.
Objectif des travaux de thèse
Nous avons vu que l’expression d’un grand nombre de gènes des deux partenaires était modulée par la symbiose mycorhizienne. L’extinction de la transcription de ces gènes par l’utilisation de mutants ou par l’usage d’organismes modifiés génétiquement, produisant des ARN d’interférences (Coleman et al., 1984; Mizuno et al., 1984; Elbashir et al., 2001a; Elbashir et al., 2001b) a permis de mettre en évidence de nombreux gènes codant pour des protéines essentielles au bon développement de la symbiose mycorhizienne. Pour une partie de ces protéines, leur rôle et leur fonction dans la symbiose ne sont pas définis. La croissance du champignon MA à l’intérieur des racines et le développement d’arbuscules au niveau des cellules corticales requièrent de nombreux processus cellulaires. Cela laisse présager une régulation et une signalisation complexes (Harrison, 2005b). Malgré tous les travaux menés sur la symbiose mycorhizienne et la grande quantité de données accumulées, nos connaissances sur le développement et le maintien de cette interaction restent parcellaires. Les mécanismes de régulations sont encore largement inconnus et la mise en évidence de ces processus demeure un défi.
Notre objectif a été d’identifier des métabolites d’origine fongique ou végétale qui jouent un rôle, in planta, dans la régulation de la symbiose mycorhizienne à arbuscule. Nous nous sommes focalisés sur les petites molécules (taille moléculaire < 1 500 Dalton). Pour cela nous avons suivi une stratégie en trois étapes (Figure 1-
29 8).
Figure 1-8 Schéma général de la stratégie mise en place pour identifier des molécules impliquées dans la symbiose.
Cette stratégie se décompose en trois parties : (I) la mise en évidence des différences métaboliques entre des extraits de racines mycorhizées ou non mycorhizées grâce à des analyses différentielles par spectrométrie de masse (profils métabolomiques). (II) Un bio-essais visant à sélectionner les molécules pouvant avoir un rôle dans cette symbiose. Pour cela une analyse transcriptomique permet de mettre en évidence les molécules qui affectent des gènes spécifiques de la mycorhization. (III) les molécules criblées comme différentielles et affectant l’expression de gènes spécifiques de la symbiose sont ensuite pré purifiées, caractérisées chimiquement et testées à nouveau sur l’expression des gènes en vue d’une identification structurale.
Au cours des dernières années, grâce aux avancées technologiques importantes dans les domaines de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse, ont émergé de nouveaux outils analytiques, permettant des analyses globales telles que la métabolomique. Aujourd’hui, une analyse de métabolomique différentielle permet de comparer simultanément plusieurs milliers de analytes entre différents échantillons (Dunn et al., 2011), ce qui en fait une technique de choix pour des investigations sans apriori (Patti, 2011). Cette approche est particulièrement justifiée dans les cas où les connaissances biologiques sont limitées. La somme des données accumulées et leurs analyses permettent une exploration du métabolome dont les résultats engendrent souvent la naissance de nombreuses études plus
30 ciblées (Kell et Oliver, 2004). La première partie du travail a été consacrée à la mise en place de la méthode expérimentale et à l’ensemble du processus analytique (Chapitre 1) pour mener une étude comparative des métabolomes de racines mycorhizées et non mycorhizées.
La deuxième partie du travail a consisté à traiter les données afin de définir les composés présents en plus grande quantité dans les racines mycorhizées. Ensuite nous avons tenté de repérer parmi les différentes molécules criblées par les profils métaboliques celles qui pourraient jouer un rôle régulateur dans la symbiose. Le métabolome des deux conditions (mycorhizée ou non) a été fractionné par HPLC préparative pour tester l’effet des différentes fractions sur l’expression de certains gènes d’intérêts du champignon MA (Chapitre 2).
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