O fluoróforo hibridizado preparado (175) será importante para a realização de ensaios biológicos que possam fornecer importantes informações sobre as vias de ação do núcleo marinoquinolínico. Mas para isso, é preciso saber como esse fluoróforo vai interagir como meio biológico alvo. É necessário que esses híbridos se mantenham
potentes e não sejam tóxicos, dessa forma. Os compostos (151 e 175) passarão por testes de toxicidades para saber se será possível utilizar os fluoróforos como sondas fluorescentes.
A fluorescência pode ser fenômeno mensurável e em sua maioria é identificado em moléculas de compostos orgânicos. Por dependerem de transições de elétrons, alguns rigores ligados a estrutura e a eletrônica são essenciais para que uma molécula orgânica apresente fluorescência, bem como a rigidez da estrutura, a conjugação do sistema eletrônico, a planaridade da estrutura da substância e a presença de substituintes que tornam os sistemas ricos em elétrons.
Em sistemas biológicos, as biomoléculas podem apresentar uma fluorescência intrínseca, mas esta se apresenta com baixa intensidade. Dessa forma, moléculas com propriedades fluorescentes podem ser ligadas a diferentes sistemas biológicos, como proteínas e membranas, tornando-os detectáveis em ensaios fluorimétricos em baixíssimas concentrações. Essa aplicação tem um papel importante na química medicinal, contribuindo principalmente na busca por alvos biomoleculares, o que propicia a ciência valiosas informações sobre o mecanismo de ação e resistência de drogas.
2. 5 Conclusões e perspectivas
Nesta etapa do trabalho, foi desenvolvida uma adaptação sintética para facilitar o preparo de derivados marinoquinolínicos (3H-pirrolo[2,3-c]quinolina), utilizando como etapas chave as reações de acoplamento de Suzuki-Miyuara e a ciclização de Pictet-Spengler. A metodologia passou por otimizações que consistiu drástica redução de catalisador, sendo necessários 0,5 mol% de pré-catalisador (Pd(OAc)2) e 1,0 mol de ligante (SPhos) para gerar produtos de acoplamento em escalas de gramas. A reação de Suzuki-Miyuara demonstra versatilidade para a síntese dos derivados de marinoquinolinas e tem sido utilizada pela equipe de Química Medicinal do grupo de pesquisas por tolerar uma vasta variedade de substratos.
A síntese de um importante substrato, o boropinacolato (67) também passou por otimizações e pode ser conduzida em três etapas reacionais sem a necessidade de processos de purificação dos intermediários 111 e 122 (Esquema 23). A preparação do derivado pinacol borana (67) foi realizada em escala de gramas e o mesmo pode ser isolado com processos de cristalização realizados com metanol/água, obtendo-se elevados rendimentos para esse substrato.
A reação de Pictet-Spengler teve que necessariamente passar por otimizações, as condições descritas pelo grupo no trabalho realizado pela Prof. Dr. Cristiane Schwalm em seu doutoramento foram importantes para o andamento das pesquisas, mas as condições ainda que consideradas drásticas, geravam os derivados de interesse em rendimentos moderados, no entanto, os brutos reacionais eram complexos, sendo necessário investir um bom tempo de trabalho para realizar as purificações dos derivados marinoquinolínicos. Com as condições estabelecidas para a reação de ciclização de Pictet-Spengler, foi possível realizar a ciclização de aldeídos e pirroloanilinas, sendo necessário tão somente 50 mol% de ácido trifluoroacético, conduzida sob temperatura ambiente. Esse método torna ágil a preparação de derivados funcionalizados na posição 4 do núcleo 3H-pirrolo[2,3-c]quinolina. Nessas condições a reação demonstrou ser mais comportada, gerando brutos reacionais menos complexos para a purificação em baixos tempos reacionais. A reação demonstrou elevada tolerabilidade de substratos, sendo possível utilizar aldeídos com diferentes substituintes, incluindo aminas livres (137 e 151) e grupos protetores (157 e 159).
Foi possível preparar 39 análogos que foram direcionados para os estudos de investigação antimalárica. Os rendimentos globais para a síntese desses análogos
ficaram entre 35 e 59% para os análogos não metoxilados (23 - 25 e 27, 129 - 143), entre 33 e 61% para os análogos metoxilados (144 - 160) e entre 13 e 18% para os análogos bromados (161 - 163).
A rota sintética aqui apresentada, tem sido importante para o progresso do trabalho de química medicinal desenvolvida no grupo de pesquisas, pois essa metodologia sido útil para preparar novos análogos oriundos do planejamento realizado para o desenvolvimento de compostos bioativos aplicados em diversas doenças, embora o grupo tenha se dedicado a estudar doenças negligenciadas, algumas outras colaborações têm ampliado o espectro de aplicações biológicas envolvendo os análogos gerados.
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3 Resultados dos testes biológicos
3. 1 Desenvolvimento de um composto líder contra cepas de Plasmodium falciparum
Para malária, a validação de um composto hit tem como critério inicial identificar, através de estudos in vitro, de um composto que atue em concentrações abaixo de < 1 µM contra linhagens de Plasmodium spp. A citotoxicidade é outro parâmetro importante, um hit requer um valor de índice de seletividade (IS) entre a citotoxidade e potência inibitória frente ao parasito com uma razão superior a 10. As linhagens de células de mamíferos utilizadas para a determinação do índice de seletividade são células de hepatoma humana (HepG2), devido a sua ligação com o mecanismo de primeira passagem.47
O desenvolvimento do composto líder requer uma molécula com potência in vitro numa escala de concentração na faixa de nanomolar (nM). O ideal é que essa potência seja < 100 nM contra linhagens de Plasmodium spp sensíveis e multirresistentes. Neste estágio, o composto líder em fase de otimização deve ter um índice de seletividade superior a 100. Os critérios de eficácia in vivo, sugere que um composto líder deve diminuir o desenvolvimento de 90% do alvo patogênico, com doses de até 50 mg por quilo do modelo animal infectado. Os estudos de absorção, distribuição, metabolismo e eliminação da droga, bem como o estudo da atividade em diferentes ciclos de vida do parasita, são de muita importância na validação de um composto líder.1 Os critérios descritos acima serão utilizados para racionalizar a escolha dos compostos hits e líderes no processo de desenvolvimento do candidato a fármaco antimalárico.
3. 2 Resultados dos estudos in vitro e relação estrutura-atividade
A biblioteca de compostos sintetizada foi enviada para o Laboratório Multiusuário de Cristalografia Estrutural - (LMCE), localizado no Instituto de Física de São Carlos da Universidade de São Paulo, as pesquisas desenvolvidas no LMCE são
47
Katsuno, K.; Burrows, J. N.; Duncan, K.; van Huijsduijnen, R. H.; Kaneko, T.; Kita, K.; Mowbray, C. E.; Schmatz, D.; Warner, P. Slingsby, B. T. Nat. Rev. Drug. Discov. 2015, 14, 751.
coordenadas pelo Pesquisador Dr. Rafael V. C. Guido, que juntamente com Dra. Anna Caroline C. Aguiar e o Doutorando Guilherme Eduardo de Souza foram responsáveis por realização dos ensaios in vitro e in vivo contra a cepa de P. falciparum (3D7) sensível a cloroquina e a cepa K1 resistente a cloroquina e os testes in vivo.
3. 3 Avaliação do substituinte R1 do núcleo 3H-pirrolo[2,3-c]quinolina: série
análoga aos compostos naturais MQa, MQb, MQc e 129-143
Em uma triagem inicial, concentramos os nossos esforços na otimização do substituinte R1 descrito na Tabela 3. Entre as marinoquinolinas naturais apenas a MQb
(24) mostrou-se ativa numa escala de baixo micromolar (CI50 = 4,1 µM, IS = > 71) e com esses resultados a MQb foi selecionada como hit para nossa investigação inicial de relação estrutura-atividade. A troca do grupo isobultil pelo grupo etil 132 ou fenil 129 não apresentaram potências superiores ao hit. Entretanto, embora o composto 129 seja quase inativo, sua citotoxicidade foi > 75, identificando o grupo fenil como um bom grupo a ser explorado.
Considerando esses resultados, sintetizamos algumas marinoquinolinas com substituições no grupo fenil, são elas: 4-OMe (130), 3,5-dimetoxi (133), 3,4,5-trimetoxi (134), Cl (135), Br (136), NO2 (131), NH2 (137), NMe2 (138), CO2H (139) e CO2Me (140). Embora nenhuma substituição tenha incrementado a potência do composto hit, algumas moléculas apresentaram boas seletividades, tendo como mais interessante o inibidor 138 (CI50 = 5,8 µM, IS > 104). Embora o composto 140 tenha potência aproximada ao hit, o mesmo apresenta um bom índice de seletividade, tornando mais atrativo o composto 138 (Tabela 3).
Embora a MQe (27) seja inativa nas concentrações testadas, optamos por explorar alguns derivados indólicos devido a importância desse núcleo em atividade antiplasmodial. Além da MQe, outros três compostos foram sintetizados 141, 142 e 143. Com a funcionalização do indol na posição 2 (143), obtivemos uma potência equimolar e uma baixa citotoxicidade (CI50 = 4,8 µM, IS > 155) (Tabela 3).
Tabela 3: Atividade Inibitória de marinoquinolinas frente a culturas de Plasmodium falciparum. R1/Composto CI50 (µM) P. falciparum (3D7 cepas) MLC50 (µM) HepG2 Índice de seletividade (IS) Metil - 23 ˃ 10 N.D.*,a N.D. . 24 4,1 ± 0,2 > 250 > 61 25 ˃ 10 N.D. N.D. 27 10,4 ± 0,4 > 750 >72 129 > 10 > 750 > 75 130 6,7 ± 0,4 > 250 > 37 131 ˃ 10 N.D. N.D. 132 7,3 ± 0,9 151 ± 5 21 133 4,9 ± 0,1 > 250 > 51 134 9,2 ± 0,8 99 ± 7 11 135 10,5 ± 0,5 > 250 > 23 136 ˃ 10 N.D. N.D. 137 7,7 ± 0,7 41 ± 2 Tóxica 138 5,8 ± 0,2 > 250 > 43
139 12,1 ± 0,1 82 ± 4 Tóxica 140 4 ± 2 > 250 > 63 141 12,3 ± 0,4 93 ± 7 Tóxica 142 6,2 ± 0,1 42 ± 16 Tóxica 143 4,8 ± 0,2 746 ± 2 155 Artesunato 15 0,006 ± 0,002 198 33000 a
N.D. = Não detectado. Os compostos com valores de CI50 superiores a 10 µM não tiveram suas
citotoxidades e seletividades determinadas.
Nessa primeira série de compostos gerada, as substituições realizadas correspondentes ao grupo fenil são, em alguns casos toleráveis em mesmo não havendo melhora na potência, alguns inibidores se mostram equipotentes e com baixa citotoxidade.
3. 4 Avaliação do substituinte 4-R1 do núcleo 7-metoxi-3H-pirrolo[2,3-c]quinolina:
compostos 144-160
Uma nova série com 12 análogos foi sintetizada substituindo a posição 7 com uma metoxila descritos na Tabela 4, cabe ressaltar que nenhuma das moléculas dessa série foram tóxicas. Todas elas apresentaram IS > 10. Dos derivados substituídos com grupos alquílicos na posição 4 (144, 145 e 146) apenas o substituinte isobutil (144) apresentou uma boa potência (CI50 = 0,5 µM) e um moderado índice de seletividade (IS = 70).
Alguns derivados fenílicos também foram testados (147 - 155) e apresentaram resultados interessantes, dando destaque para os compostos 152 e 155 que foram os mais ativos dos derivados fenílicos 152 (CI50 = 0,4 µM, IS = 45) e 155 (CI50 = 0,6 µM, IS > 417), respectivamente. O composto 152 demonstrou ser mais potente contra o
parasito e o 155, além de ser potente, se destaca por ser menos citotóxico. O derivado benzílico (156) não foi ativo, mas se destacou em não ser citotóxico.
Tabela 4: Atividade Inibitória de marinoquinolinas frente a culturas de Plasmodium
falciparum. R1/Composto CI50 (µM) P. falciparum (3D7 cepas) MLC 50 (µM) HepG2 Índice de seletividade (IS) 144 0,5 ± 0,2 35 ± 1 70 Metil 145 5,4 ± 0,3 > 250 > 46 146 ˃ 10 N.D.a N.D. 147 2,4 ± 0,5 60 ± 2 25 148 1,0 ± 0,5 > 250 > 250 149 9,9 ± 0,1 > 750 75 150 1,9 ± 0,1 144 ± 38 76 151 1,3 ± 0,1 > 750 > 576 152 0,4 ± 0,1 18 ± 2 45 153 > 10 > 750 > 75 154 1,3 ± 0,5 > 250 > 192 155 0,6 ± 0,3 > 250 > 417 156 10,3 ± 0,7 478 ± 8 46
Artesunato 15 0,006 ± 0,002 198 33000
a
ND = Não detectado. Os compostos com valores de CI50 superiores a 10 µM não tiveram suas
citotoxidades e seletividades determinadas.
Essa série de compostos testados, revelou que os análogos não naturais metoxilados são, na maioria dos casos, mais potentes e menos citotóxicos que seus respectivos análogos não metoxilados. Na figura 4 (pag. 8), estão ilustrados os fármacos quinolínicos de uso terapêuticos (2 - 5) e todos eles contam com uma metoxila em sua estrutura. Nessa linha, a modificação eletrônica provocada pela metoxila tem um importante papel na atividade desses sistemas frente ao P. falciparum.
3. 5 Análogos preparados baseados na relação da estrutura-atividade (SAR)
A metoxila se apresentou como um ótimo substituinte na posição 7, onde os análogos gerados foram, em sua grande maioria, são ativos contra o Plamodium falciparum e juntamente a isso, os valores de mínima dose letal os caracterizam como uma classe de compostos bastante segura para se investir no planejamento e desenvolvimento de novos análogos.
Dessa forma, foi priorizado a síntese de compostos derivados do inibidor mais potente da série (152), três novos compostos foram sintetizados (157-159) Tabela 5. Segundo os resultados, o composto 157 não foi ativo contra o parasito, o que foi comprovado pelo teste de inibição (CI50 ˃ 10 µM). Por outro lado, as potências inibitórias dos compostos 158 e 159, mostraram-se superiores aos valores obtidos para toda a séries de compostos metoxilados (CI50 ˃ 0,061 µM) e (CI50 ˃ 0,039 µM) respectivamente. O teste de citotoxicidade contra células HepG2 indica que o composto 158 pode apresentar toxicidade em baixas concentrações do inibidor (MLC 50 = 20 µM), o índice de seletividade para 158 está numa faixa interessante, mas isso só foi possível devido ao excelente potencial de inibição apresentado (Tabela 5).
O composto 159 foi o que se demonstrou ser o mais potente e seletivo, sua citotoxicidade (MLC 50 ˃ 250 µM) indica que esse inibidor é o menos citotóxico de toda a série de análogos de marinoquinolinas e quando comparado a referência utilizada no teste, o artesunato (MLC 50 = 198 µM). A alta atividade e a baixa citotoxicidade do inibidor 159 se veem refletido no elevado valor de índice de seletividade (IS ˃ 6400) (Tabela 5).
Tabela 5: Atividade Inibitória de marinoquinolinas frente a culturas de Plasmodium falciparum. R1/Compostos CI50 (µM) P. falciparum (3D7 strain) MLC 50 (µM) HepG2 Índice de seletividade (IS) 157 ˃ 10 N.D. a N.D. 158 0,061 ± 0,002 20 ± 3 328 159 0,039 ± 0,004 > 250 > 6410 Artesunato 0,006 ± 0,002 198 33000 a
ND = Não determinado. Os compostos com valores de CI50 superiores a 10 µM não tiveram
suas citotoxidades e seletividades determinadas.
Com tais resultados obtidos para o composto 159, o mesmo foi selecionado juntamente com os compostos 144 e 155 para serem submetidos a inúmeros ensaios biológicos com o propósito de identificar a real eficácia de suas ações biológicas (Figura 14).
Figura 14: Estruturas dos inibidores selecionados 144, 155 e 159 para demais ensaios biológicos.
Para a caracterização de um composto líder contra infecções geradas por espécies de Plasmodium é necessário que um inibidor tenha um bom desempenho nos testes in vivo, deve demonstrar atividade contra cepas resistentes, ser ativo contra determinados estágios de vida dos parasitos e propriedades físico químicas muito bem definidas.
3. 6 Resultados dos estudos in vivo dos compostos 144, 155 e 159.
Segundo os critérios estabelecidos para um bom composto líder, o mesmo deve reduzir a parasitemia em aproximadamente 90% em doses de 50 mg/kg, nos testes envolvendo ratos como modelo animal. O inibidor 159 foi administrado através de vias oral e intraperitoneal e apresentou uma redução da parasitemia de 62% e 60% respectivamente. No quinto dia após a infecção, a redução avaliada nos dias 7 e 9 após infecção se mantiveram em boas médias (Tabela 6), o experimento foi acompanhado por 30 dias e os modelos animais tratados com o inibidor 159 foram a óbito em média no vigésimo quarto dia.
Embora os valores de redução da parasitemia não tenham sido elevados, os valores se mantêm em uma boa média nos intervalos de dias de avaliação, sendo este considerado um inibidor ativo em testes in vivo. Foram avaliados também o composto hit 144 e o 155, entretanto ambos não demonstraram atividade de redução da parasitemia in vivo.47
Tabela 6: Porcentagem de redução da parasitemia após o tratamento com 144, 155 e 159.
Compostos Dose
(%) de redução de parasitemia Sobrevivência Dias de infecção Dias 5 7 9 144 50 mg/Kg 0 0 0 23 ± 6 155 50 mg/Kg 0 0 0 22 ± 6 159 V. Oral 50 mg/Kg 62 43 56 25 ± 3 159 V. intraperitoneal 50 mg/Kg 60 36 55 24±4 Cloroquina 20 mg/Kg 100 100 100 >30 Sem tratamento - - - - 19 ± 5
Antes do início dos testes nos modelos animais, os inibidores 144, 155 e 159 tiveram suas respectivas toxicidades in vivo determinadas em dois testes isolados. Um primeiro teste foi realizado administrando uma dose única dos inibidores na concentração de 1000 mg/Kg do modelo animal e os mesmos não se mostraram tóxicos no período de 30 dias em que foram avaliados. Em seguida, a sobrevivência dos animais
foi avaliada paralelamente aos ensaios da avaliação da potência in vivo. A marinoquinolina 159 se apresentou como um composto não tóxico, aumentando a sobrevida dos animais. No período de 30 dias em que os ratos foram acompanhados, os mesmos apresentaram ganho de massa corporal no decorrer do tratamento, justificando a baixa toxicidade do inibidor 159 (Figura 15).
Figura 15: Teste de toxicidade in vivo dos inibidores 144, 155 e 159.
3. 7 Testes de interação entre artesunato e marinoquinolinas
Para um eficiente processo terapêutico da malária, as combinações de medicamentos a base de derivados artemisinina (TCA) são importantes pontos a serem considerados. Nesse contexto, foram avaliadas as possíveis interações medicamentosas dessas moléculas com artesunato contra P. falciparum em ensaios in vitro. O ensaio teve o propósito de elucidar os potenciais benefícios e limitações das marinoquinolinas em combinação com fármacos antimaláricos.48
A concentração dos derivados de marinoquinolina correspondentes aos valores CI50 em combinação com artesunato foram avaliadas em uma relação fixa de 1:1, para ser determinado o índice de combinação (do inglês, combination índex, CI). O CI determina a interação entre dois ou mais fármacos e é definido pela soma da concentração inibitória de cada fármaco, que corresponde à relação entre o CI50 de cada
48
Fidock, D. a; Rosenthal, P. J.; Croft, S. L.; Brun, R.; Nwaka, S. Nat. Rev. Drug Discov. 2004, 3, 509– 520. Tempo (dias) % S ob re
vivência Não tratados
Cloroquina 50mg/kg 155 50mg/kg
159 via oral - 50mg/kg 159 via IP - 50mg/kg 144 50mg/kg
droga utilizada em combinação e o CI50 do mesmo fármaco testado isoladamente. Um índice FIC = 1 indica uma interação aditiva do fármaco, índice FIC < 1 uma interação sinérgica e índice FIC > 1 uma interação antagonista.
Uma combinação que apresenta efeitos de sinergismo é um cenário ideal para a combinação de fármacos, pois é possível que os fármacos combinados causem o efeito terapêutico em doses menores. Os compostos combinados que causam efeitos antagônicos não são indicados para terapia, nesses casos, doses superiores podem ser necessários para atingir os efeitos requeridos.49 Como pode ser visto na Tabela 7, o FIC para os inibidores selecionados variam de 0,9 ± 0,1 a 1,3 ± 0,1, sugerindo um efeito aditivo quando combinada com artesunato. Embora não ocorra incremento de potência nessas combinações, existem vantagens particulares em terapias envolvendo combinações de fármacos, como a baixa possibilidade de o parasito adquirir resistência.
Tabela 7: Atividade inibitória e índice fracional da concentração inibitória (índice FIC) de derivado de marinoquinolinas (144, 155 e 159) em combinação com artesunato 15 (relação fixa
de 1:1). Compostos P. falciparum – 3D7 CI50 nM Índice FIC 15 3,1 - 144 500 - 155 600 - 159 39 - 144 + 15 2,3 0,89 ± 0,09 155 + 15 2,2 1,3 ± 0,1 159 + 15 2,0 0,87 ± 0,09
Em todas marinoquinolinas testadas em combinações foram observados incrementos em suas respectivas atividades e esses dados são importantes, por que eles demonstram que essas combinações de drogas não interferem na ação de ambas contra o parasito.
3. 8 Testes de estabilidade metabólica in vitro dos compostos 144, 155 e 159
Os três inibidores mais ativos nos testes in vitro 144, 155 e 159 tiveram suas estabilidades metabólicas determinadas frente a microssomas de fígado de rato (Figura 16). Avaliando os resultados de incubação desses inibidores, observa-se que o verapamil e os compostos 144 e 155 foram muito metabolizados, suas respectivas estabilidades foram consideradas baixas (24%, 15% e 10%), o que justifica a inatividade dos derivados 144 e 155 frente ao Plasmodium Berghei utilizado nos ensaios in vivo.
Avaliando o inibidor mais potente 159, a sua estabilidade metabólica diminui em aproximadamente 50% a concentração da molécula, em comparação aos outros dois análogos a sua estabilidade em 30 minutos de incubação foi considerada moderada (Figura 16). A elevada atividade da marinoquinolina 159 (CI50 = 0,039 µM) (Esquema 29), pode ser justificada pela formação de um dos possíveis metabólitos que podem ser gerados, a exemplo, o grupo carbamato presente no inibidor 159 pode ser facilmente hidrolisado no meio biológico formando o derivado 151, sendo uma marinoquinolina que apresenta moderada atividade contra Plasmodium falciparum (CI50 = 1,3 µM). Esse metabólito apresenta propriedades interessantes quando comparado ao 159, dentre elas, uma melhor solubilidade (cLogP = 2,8), sendo também não citotóxico numa elevada concentração do metabólito 151 em células de mamífero (MLCHepG2 = > 750 µM) (Esquema 33).
Figura 16: Avaliação da estabilidade metabólica dos inibidores 144, 155 e 159 em microssomas de fígado de rato.