4.3 Le domaine N-terminal
4.5. L’ATPase à cuivre de Saccharomyces cerevisiae Ccc
4.5.1. La découverte de Ccc2
Le gène de Ccc2 a été découvert en 1995 comme suppresseur du phénotype d’une souche csg1
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(Calcium Sensitive Growth), souche hypersensible au calcium et déficiente dans la mannosylation des sphyngolipides (Fu et coll. 1995). Ce phénotype est à l’origine du nom de Ccc2 pour Ca2+-sensitive Cross Complementation. Situé sur le chromosome IV, CCC2 est un gène constitué de 3015 pb codant pour une protéine de 1004 acides aminés.4.5.2. Prédiction de structure de Ccc2
La topologie de Ccc2 peut être prédite sur la base des alignements de séquence des ATPases de type P1 (Axelsen et Palmgren 1998). Ccc2 possède l’ensemble des caractéristiques de ces ATPases. Son domaine N-terminal comporte deux domaines de liaison aux métaux lourds MBD1 et MBD2 dont la structure est similaire à celle des autres MBD. La prédiction de structure de Ccc2 comporte huit hélices transmembranaires : les quatre premières, TM1-TM4, sont situées en amont de la petite boucle cytoplasmique contenant le motif TGE, les hélices TM5 et TM6 séparent la petite de la grande boucle cytoplasmique qui elle contient les motifs caractéristiques des ATPases de type P1 : DKTGT, HP et GDGINDIP ; enfin les hélices TM7 et TM8 concluent la protéine en C-terminal.
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Figure I.4.7 : Prédiction de structure et caractéristiques l’ATPase de S. cerevisiae Ccc2 (d’après (Lowe et coll. 2004)).
4.5.3. La fonction de Ccc2
Ccc2 est localisée dans le réseau trans-golgien (ou TGN pour Trans Golgi Network), un compartiment postérieur au Golgi dans la voie sécrétoire et qui précède les compartiments endosomaux (Yuan et coll. 1997). Son rôle est de transférer le cuivre cytosolique dans la lumière du réseau trans-golgien en utilisant l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP. Le cuivre ainsi transféré permet l’activation des enzymes à cuivre néo-synthétisées dans la voie sécrétoire. Ainsi, Ccc2 intervient dans les voies de synthèse des céramides (Beeler et coll. 1997; Swain et coll. 2002) et dans l’import de fer de haute affinité (Yuan et coll. 1995). En effet, l’oxydase à cuivre Fet3 forme avec la perméase Ftr1 le complexe d’import de fer à haute affinité et l’inactivation de ce complexe augmente la sensibilité des levures à une carence en fer. Ainsi Ccc2 est un élément clef de l’imbrication de l’homéostasie du cuivre et du fer. L’invalidation du gène CCC2 ou du gène de sa chaperonne ATX1 entraîne un déficit en cuivre dans la voie sécrétoire qui n’est alors plus capable d’activer le complexe Fet3/Ftr1 responsable de l’import du fer à haute affinité. Le phénotype qui découle de la rupture de la voie Ccc2 – Atx1 a été mis à profit lors de la thèse d’Isabelle Morin (Morin 2005) pour étudier les interactions entre l’ATPase et sa chaperonne. Isabelle a ainsi pu montrer in vivo que (i) le transfert du cuivre d’Atx1 vers MBD1 ou MBD2 rétablit la voie Atx1-Ccc2 avec la même efficacité, (ii) Atx1 ne peut transférer le cuivre à Ccc2 si Ccc2 ne comporte pas de MBD fonctionnel, (iii) un MBD amené en trans sous forme cytosolique et indépendant de
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Ccc2 est capable de transférer le cuivre à Ccc2. Ces résultats suggèrent des différences fonctionnelles entre Atx1 et les MBD, malgré leur forte identité de structure et de séquence. De plus, ils indiquent que le cuivre des MBD est directement transféré au reste de la protéine par les MBD, le site recevant le cuivre des MBD restant à identifier.
L’activation du complexe Fet3/Ftr1 nécessite également la présence des protéines Tfp1 et Gef1 actives (Gaxiola et coll. 1998). Tfp1 est une sous-unité de Vma1, l’ATPase proton de la vacuole et Gef1, un canal chlore. L’implication de ces deux protéines est probablement indirecte. Vma1 permettrait l’acidification du lumen des vésicules du TGN et Gef1 assurerait le maintien du potentiel de membrane des vésicules par le transport des ions Cl- comme contre-ions.
4.5.4. La régulation de Ccc2
La régulation de Ccc2 a été peu étudiée. L’analyse du transcriptome en carence ou excès de cuivre ne révèle pas de régulation transcriptionnelle de Ccc2 en réponse à ces variations (Gross et coll. 2000; van Bakel et coll. 2005; Jo et coll. 2008). Cependant, l’analyse du transcriptome d’une souche de levure dont le gène du facteur de transcription Mac1 a été inactivé révèle une augmentation de la transcription de Ccc2 (De Freitas et coll. 2004). Une telle souche peut être considérée comme une souche en carence de cuivre chronique et, de par le rôle du cuivre dans l’import de fer à haute affinité, cette souche est aussi carencée en fer. Or, Aft1, le facteur de transcription qui répond à une carence en fer régule l’expression de Ccc2 (Yamaguchi-Iwai et coll. 1996). Dans une levure souffrant d’une carence en fer, Aft1 se lie sur le promoteur de Ccc2 activant ainsi sa transcription. Il est donc probable que l’activation de la transcription de Ccc2 dans la souche mac1
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soit due à la carence chronique en fer de cette souche (De Freitas et coll. 2004). Renforçant cette hypothèse, cette étude montre que d’autres gènes connus pour être activés par Aft1 sont aussi surexprimés, tel FET3, gène de l’oxydase du complexe d’import de fer à haute affinité ou FIT3, gène d’une protéine de la paroi impliquée dans la fixation des sidérophores.Récemment Valverde et coll. (2008) ont étudié la régulation de l’activité catalytique de Ccc2 par la PKA, la protéine kinase dépendante de l’AMPc. Les auteurs observent la phosphorylation de la sérine 258 par la PKA, phosphorylation qui dépend de la présence de cuivre et qui modulerait l’activité de Ccc2.
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