B. Évolution des dispositions contestées
3. I de l’article L. 136-6 du code de la sécurité sociale
A Figura 4.26 mostra os espectros Raman obtidos para o terpolímero Ru/sty/DVB e para o nanocompósito Ru/sty/DVB + Ag (H2O) (amostras 1 e 2, respectivamente) seguidos dos espectros dos monômeros, o complexo trans- [RuCl2(vpy)4] e o poli-sty, e do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]}, obtidos por polimerização eletroquímica [11], para comparação.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 0 10000 20000 30000 (c) (e) (d) (b) (a) In te ns ity / a. u. Raman shift / cm-1
Figura 4.26. Espectros Raman do (a) trans-[RuCl2(vpy)4]; (b) poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]}; (c) poli-sty;
As frequências de vibração típicas do trans-[RuCl2(vpy)4] (monômero complexo), do poli-sty, do terpolímero Ru/sty/DVB e do nanocompósito Ru/sty/DVB + Ag (H2O) estão apresentadas na Tabela 4.3. Para facilitar a discussão dos resultados, a Figura 4.27 mostra uma ampliação do espectro apresentado na Figura 4.26, abrangendo a região de 850-1180 cm-1 do espectro Raman.
1150 1100 1050 1000 950 900 850 0 10000 20000 30000 1030 1032 (e) 1056 998 997 1062 1023 1022 1013 1056 (c) (d) (b) (a) In te ns ity / a. u. Raman shift / cm-1
Figura 4.27. Ampliação dos espectros Raman na região de 850-1180 cm-1 obtidos da Figura 4.26 para:
(a) trans-[RuCl2(vpy)4]; (b) poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]}; (c) poli-sty; (d) terpolímero Ru/sty/DVB e (e)
nanocompósito Ru/sty/DVB + Ag (H2O), na região de 300-1800 cm-1.
O terpolímero e o nanocompósito (d) e (e) nas Figuras 4.26 e 4.27 apresentam bandas em 997, 1023, 1062, 1200, 1602 e 1627 cm-1. A banda em 1627 cm-1 é designada aos modos vibracionais do complexo trans-[RuCl2(vpy)4] (monômero), desde que esteja presente apenas este composto. Esta banda, designada aos modos vibracionais ν(C=C), presente no terpolímero e no nanocompósito, indica que a polimerização foi incompleta. A banda em 1062 cm-1 é designada ao monômero trans- [RuCl2(vpy)4], embora o terpolímero e nanocompósito também apresentem uma banda com baixa intensidade próxima desta faixa de frequência.
A banda em 1023 cm-1 é designada ao poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]}, que possui bandas com valores de frequência muito próximas e com intensidade razoável. As bandas em 1200 e 1602 cm-1 podem ser atribuídas ao monômero trans-[RuCl2(vpy)4] e ao polímero, pois estão presentes em ambos os compostos com forte intensidade. Por outro lado, a banda do terpolímero em 997 cm-1 pode ser seguramente atribuída ao poli- sty, pois não está presente nem no monômero complexo e nem no polímero. Com a observação detalhada das bandas do terpolímero e do nanocompósito, em 997, 1023 e 1062 cm-1, na Figura 4.27, pode ser observado que para o terpolímero, a banda a 1023 cm-1 (do poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]}) é ligeiramente intensificada em comparação a
banda a 997 cm-1 (do poli-sty) comparando-se com as mesmas bandas observadas no espectro do nanocompósito. Este fato indica que a adição de Ag no nanocompósito contribui para a intensificação das bandas do complexo. Embora não seja possível a observação em detalhes na Figura 4.26, as bandas a 1200 e 1602 cm-1, designadas ao monômero trans-[RuCl2(vpy)4] e ao seu respectivo polímero, foram também intensificadas (em comparação a banda 997 cm-1, do poli-sty) no espectro do nanocompósito, que corrobora com a hipótese do efeito da intensificação da banda realizada pela presença da Ag no nanocompósito. Um outro fator que merece menção é a intensificação das bandas na região de baixa frequência (por volta de 300-600 cm-1) no nanocompósito. Estas bandas são provisoriamente designadas às bandas do óxido de rutênio ou a alguma banda Ru-O do oxigênio presentes na composição do complexo de RuII. [12] A presença de bandas devido ao óxido de rutênio no terpolímero pode ser explicada pela oxidação do complexo pelo iniciador usado no processo de polimerização. Em trabalhos anteriores foi reportada a polimerização eletroquímica do complexo trans-[RuCl2(vpy)4] [11], e bandas na mesma região do espectro Raman foram observadas, sendo atribuídas ao óxido de rutênio. Sugere-se que a intensificação das bandas do complexo e do óxido de rutênio sejam devido a presença de átomos de Ag no nanocompósito.
Tabela 4.3. Frequências Raman (cm-1) do trans [RuCl
2(vpy)4], poli-sty, poli-{trans [RuCl2(vpy)4]}, do
nanocompósito e do terpolímero poli-{trans-[RuCl2(vpy)4]-sty-DVB} (amostras 1 e 2, respectivamente),
na região acima de 900 cm-1. trans- [RuCl2(vpy)4] poli-{trans- [RuCl2(vpy)4]} poli-sty Terpolímeros 1 e 2 998 (s) 997 (m) 1013 (m) 1032 (w) 1022 (m) 1030 (w) 1023 (m) 1056 (w) 1056 (w) 1062 (m) 1153 (w) 1180 (w) 1200 (s) 1194 (s) 1198 (w) 1200 (m) 1204 (sh) 1207 (sh) 1209 (sh) 1220 (w) 1604 (s) 1597 (s) 1600 (w) 1602 (s) 1625 (m) 1627 (m)
4.3.2.4. Estudos microbiológicos
Foram realizados testes microbiológicos com os nanomateriais sty/DVB na ausência e presença do complexo de RuII. As amostras destes materiais poliméricos com e sem Ag (H2O) incorporadas na matriz foram semeados numa placa de microcultivo contendo o meio de cultura Muller & Hynton e incubadas a 37 ºC por 24 horas. Após o período de incubação, foi observado um halo de inibição do crescimento bacteriano ao redor do polímero contendo as NPs de Ag, conforme observada na Figura 4.28 2-b. Não foi observado este halo de inibição para o copolímero e terpolímero na ausência de NPs de Ag (Figura 4.28 1-a e 2-a) e para o nanocompósito Ag/sty/DVB (Figura 4.28 1-b). Com isso, pode-se dizer que a inibição bacteriana causada pela presença das NPs de Ag no polímero contendo na matriz o complexo de RuII confere ao material características anti-sépticas. Além do mais, estas análises corroboram com os resultados obtidos nos estudos envolvendo a liberação de íons Ag+, na ausência e presença do complexo trans- [RuCl2(vpy)4] na matriz polimérica.
Figura 4.28. Placas de microcultivo contendo amostras: (1) sty/DVB e (2) Ru/sty/DVB sem NPs de Ag
(a) e com NPs de Ag em meio aquoso (b) com os microorganismos E.coli e S. aureus, respectivamente.
Foram feitos testes microbiológicos com as NPs de Ag em tolueno, incorporadas no terpolímero Ru/Sty/DVB. Observou-se o efeito inibitório do crescimento bacteriano também para este material, caracterizando-o como um material anti-séptico. A Figura
(a)
(b)
(b)
(a)
(1)
4.29 mostra a imagem obtida da placa de microcultivo onde foi semeado o microorganismo S. aureus e a amostra do nanocompósito Ru/sty/DVB + Ag (tolueno).
Observa-se nas duas amostras semeadas, o halo de inibição do crescimento bacteriano para este nanocompósito.
Figura 4.29. Imagem de uma placa de microcultivo contendo o microorganismo S.aureus com amostras do nanocompósito Ru/sty/DVB com Ag (tolueno).
A atividade antimicrobiana da prata na matriz polimérica pode ser importante para a prevenção da proliferação das bactérias aderentes na superfície de materiais poliméricos, diminuindo assim, o tempo de vida útil deste material. Matrizes poliméricas impregnadas com NPs de Ag apresenta uma nova superfície que atua na prevenção da aderência de microorganismos e de depósitos de proteínas na superfície. Este e outros tópicos relacionados com o entendimento de novos materiais são objetos de estudos conduzidos em nosso laboratório.
4.3.2.5. Estudo quantitativo da liberação de íons Ag+
Um estudo quantitativo da liberação de íons Ag+ em meios aquoso e biológico foram realizados a partir de nanocompósitos que apresentam na matriz polimérica o complexo trans-[RuCl2(vpy)4], sintetizados ex-situ com NPs de Ag. Para efeito comparativo, foram realizados estudos com o mesmo nanocompósito, sob as mesmas condições experimentais, na ausência do complexo trans-[RuCl2(vpy)4].
Estudos anteriores relatados na literatura mostraram que a presença do complexo
trans-[RuCl2(vpy)4] na matriz polimérica contribui para uma maior liberação dos íons
Ag+, em termos de concentração de Ag+ (µg.mL-1), para os meios de cultura estudados. Este estudo visa corroborar com resultados preliminares obtidos anteriormente, incluindo os resultados observados nos testes microbiológicos, em um primeiro momento em termos qualitativos.
A curva de calibração, determinada por Espectrometria de Absorção Atômica em forno de grafite (GF AAS), foi obtida utilizando padrões de Ag+ na faixa de concentração estimadas para as amostras reais. A Figura 4.30 mostra o ajuste dos resultados na curva de calibração obtida.
0 1 2 3 4 5 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 R = 0,9998 A b s o rb â n c ia Concentração de Ag (µµµµg.mL-1)
Figura 4.30. Curva de calibração usando solução padrões de 0,0; 1,0; 2,0; 3,0 e 5,0 µg.mL-1.
Foram empregadas amostras dos nanocompósitos Ru/sty/DVB e sty/DVB, sintetizados ex-situ com NPs de Ag, sendo materiais que, na presença destas partículas apresentaram característica anti-séptica conforme descrito na literatura.
Nestes estudos foram utilizados como meios reacionais, um pool de plasma humano e água ultra pura. Foram utilizadas uma quantidade em massa de 0,3 g dos nanocompósitos estudados em 25 mL de cada meio reacional. As amostras foram deixadas em banho termostatizado a 37 ºC durante 20 dias. Foram recolhidas alíquotas de cada nanocompósito em cada meio estudado, nos dias 1º, 3º, 6º, 8º, 10º, 13º, 15º, 17º, 20º. As amostras coletadas foram armazenadas a uma temperatura de 4 ºC.
A concentração de íons Ag+ liberada do nanocompósito em cada meio estudado foi determinada por Espectrometria de Absorção Atômica em forno de grafite (GF AAS), e os resultados podem ser observados nas Figuras 4.31 para plasma humano e na Figura 4.32 para água ultra pura.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 200 300 400 500 600 700 800 900 C o n c e n tr a ç ã o d e A g + ( µµµµ g .L -1 )
Tempo de imersão (dias)
Ru-sty-dvb sty-dvb
Figura 4.31. Concentração dos íons Ag+ liberados (µg.mL-1) em função do tempo para um pool de
plasma humano. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 100 120 140 160 180 200 220 240 260 C o n c e n tr a ç ã o d e A g + ( µµµµ g .L -1 )
Tempo de imersão (dias)
Ru-sty-dvb sty-dvb
Figura 4.32. Concentração dos íons Ag+ liberados (µg.mL-1) em função do tempo para água ultra pura.
As Figuras 4.31 e 4.32 mostram um significativo aumento na liberação de íons Ag+ do nanocompósito Ru/sty/DVB em comparação com o copolímero sintetizado na ausência do complexo trans-[RuCl2(vpy)4] na estrutura polimérica, desde o 1º dia de imersão.
No meio biológico, composto por um pool de plasma humano (Figura 4.31), no 1º dia de imersão, já pode ser observada uma diferença de aproximadamente 80 µg.mL-1 de íons Ag+ liberados para o meio, comparando-se o nanocompósito na presença do complexo trans-[RuCl2(vpy)4] com o copolímero sty/DVB. Esta diferença em termos
quantitativos, µg.mL-1, de íons Ag+ liberados para o meio biológico, dobra e torna a dobrar no 3º e 6º dias, respectivamente. A partir do 6º dia até o 17º dia, esta diferença permanece constante, no entanto, a concentrações elevadas, na ordem de 343 µg.mL-1 em média por dia, em um período de 10 dias, para cada alíquota coletada. A partir do 20º dia, houve uma diminuição significativa na quantidade de íons Ag+ liberados.
Para os estudos feitos em meio aquoso (Figura 4.32), e para o nanocompósito Ru/sty/DVB houve um aumento considerável na liberação de íons Ag+ para o meio, até o 9º dia, mantendo-se constante até o 19º dia. Foi observada uma diferença em termos quantitativos, µg.mL-1, de íons Ag+ liberados para o meio aquoso, de 51 µg.mL-1 no 1º dia e na ordem de 70 µg.mL-1 até o último dia estudado.
Ao se comparar os dois tipos de meios estudados, observa-se uma maior concentração de íons Ag+ liberados no meio biológico, do que em água, ambos na presença do complexo trans-[RuCl2(vpy)4]. No entanto, estes resultados mostram que a presença deste complexo metálico de RuII no polímero favorece a liberação dos íons Ag+ tanto para o meio biológico quanto em água, tornando assim um material promissor na confecção de dispositivos para aplicação na área médica.