L ‘activité de LEC2 est elle régulée post-traductionnellement ?

L’ensemble des travaux réalisés dans le cadre de ce travail s’est attaché à la régulation

transcriptionnelle de l’expression de LEC2. L’expression ectopique de LEC2 conduit à des

phénotypes sévères et la question d’une éventuelle régulation post-traductionnelle pour réguler l’abondance ou l’activité de la protéine LEC2 semble légitime.

La façon la plus simple et directe de tester si LEC2 est modifiée post-traductionnellement est d’obtenir des extraits protéiques d’embryons, de les immuno-précipiter avec des anticorps spécifiques anti-LEC2 et de réaliser un western blot sur ces extraits avec des anticorps détectant les protéines phosphorylées, ubiquitinylées et/ou sumoylées par exemple. Le problème majeur pour ce genre d’étude est que nous ne disposions pas d’anticorps anti-LEC2 (cf II.5.1) ni de construits permettant la production d’une protéine LEC2 étiquetée et fonctionnelle jusqu’à récemment (cf chapitre II.4.2). La démarche que nous avons choisie a donc été indirecte. Nous avons tout d’abord recherché des sites potentiels de modifications post-traductionnelles, nous les avons mutagénéisés et nous avons regardé l’effet produit sur

l’activité de la protéine LEC2 en testant la réversion phénotypique du mutant lec2-4. Les

prédictions in silico pour la phosphorylation et l’ubiquitination fournissent soit trop d’acides

aminés cibles pour notre démarche indirecte, soit ne sont pas assez fiables (comme la prédiction des sites d’ubiquitination). En attendant d’avoir des outils nous permettant de détecter si LEC2 est phosphorylée ou ubiquitinée, je me suis donc attachée à étudier les sites potentiels de sumoylation dont la prédiction semble facilitée par l’existence d’une unique enzyme E2 responsable du transfert du peptide SUMO sur ses cibles (pour revue (Geiss-Friedlander & Melchior, 2007)

II.4.1 La sumoylation

Ces dernières années, plusieurs équipes ont identifié, tout d’abord chez la levure

Saccharomyces cerevisiae (Meluh & Koshland, 1995), des protéines similaires

structuralement bien que présentant seulement 18% d’identité en acides aminés avec l’ubiquitine, appelées SUMO. Ces protéines peuvent se fixer de façon réversible et covalente à des protéines cibles. Contrairement à l’ubiquitine, elles ne semblent pas orienter les protéines vers la dégradation, mais peuvent, au contraire, entrer en compétition avec l’ubiquitination au niveau des mêmes résidus lysine et ainsi protéger cette protéine de la dégradation par le protéasome 26S (Ulrich, 2005). La sumoylation peut modifier la structure

d’une protéine, ou ses interactions avec ses partenaires et, ainsi, en modifier sa fonction (Geiss-Friedlander & Melchior, 2007) ou sa localisation (Terui et al, 2004). La sumoylation est donc susceptible de modifier la stabilité, la localisation ou l’activité d’une protéine (Geiss-Friedlander & Melchior, 2007). La sumoylation a été impliquée dans un grand nombre de mécanismes chez la levure et les métazoaires, comme le cycle cellulaire, la maintenance de l’intégrité du génome, le transport sub-cellulaire et la répression ou l’activation de la transcription de certaines cibles (pour revue (Hay, 2005). Il existe une seule enzyme responsable du transfert des protéines SUMO, ce qui permet de déterminer un site consensus cible de sumoylation de façon plus fiable que pour l’ubiquitination. De plus, les mécanismes animaux de sumoylation semblent conservés chez les plantes (Kurepa et al, 2003; Novatchkova et al, 2004) et touchent la signalisation, le développement et les réponses aux signaux hormonaux et environnementaux (Kurepa et al, 2003; Lois et al, 2003; Miura et al, 2007; Miura et al, 2005; Murtas et al, 2003; Saracco et al, 2007; Yoo et al, 2006).

II.4.2 LEC2 et la sumoylation

Dans le but de déterminer si des acides aminés de la protéine LEC2 peuvent être potentiellement la cible d’une sumoylation, la séquence protéique de LEC2 a été analysée avec le logiciel de prédiction sumosp (http://sumosp.biocuckoo.org). En réglant le seuil de sensibilité au plus bas, j’ai pu identifier deux sites potentiels (Figure 21A). J’ai modifié ces deux lysines (K) en arginines (R) afin d’empêcher une fixation du résidu SUMO potentiel, sans modifier les propriétés de la protéine dans cette zone. Le deuxième site potentiel est situé dans le domaine B3 essentiel à la fixation du facteur de transcription à l’ADN. Trois construits ont été réalisés : deux construits avec chaque lysine mutée individuellement et un construit contenant les deux lysines mutées. Ces construits ont été réalisés dans

pBIB-Hyg-GTW, introduits dans le mutant lec2-4 et les descendants ont été analysés. J’ai sélectionné des

plantes 100% résistantes à l’hygromycine et homozygotes pour la mutation lec2-4 puis

confirmé l’absence de phénotypes lec2 mutants dans ces lots de graines (Figure 21B). J’ai

donc pu montrer que, si sumoylation il y a, elle n’a aucun impact sur la fonction de la protéine LEC2, les protéines modifiées permettant une restauration complète du phénotype. L’abscence de sumoylation aurait également pu mener à une sur-accumulaiton de la protéine LEC2, dans ce cas, le phénotype de prolifération cellulaire observé chez des surexpreseurs de la protéine LEC2 aurait été détectés, ce qui n’a pas été le cas (Stone et al, 2001). L’influence

Figure 21: Effet de la mutation des sites potentiels de sumoylation sur la protéine LEC2. (A) Les 2 lysine (K) prédites comme des sites potentiels de sumoylation dans la protéine LEC2 sont indiquées en gras et mutées en arginine (R). (B) Photographies des graines des plantes sauvages, lec2.4 et lec2.4 complémentées par des construits PLEC2:LEC2, PLEC2:LEC2K₁₃₆, PLEC2:LEC2K₁₉₀ et PLEC2:LEC2K_136+190.

Domaine B3 170 274 362 VDSKRQL 136 (LEC2K₁₃₆) R VLPKRDA R (LEC2K₁₉₀) A lec2 PLEC2:LEC2 WT PLEC2:LEC2K₁₃₆ PLEC2:LEC2K₁₉₀ PLEC2:LEC2K_136+190 Fond génétique ^Construit Aucun Aucun B

de la sumoylation ne sera donc pas étudiée plus avant, bien que la présence d’un site de sumoylation dans le domaine B3 pouvait laisser envisager une modification possible du site de liaison à l’ADN.