Partie 3 : Matériel et méthodes
5. L’évaluation de l’activité antioxydante :
Les méthodes d’évaluation du caractère antioxydant sont nombreuses et peuvent être qualitatives ou quantitatives. Les méthodes qualitatives, utilisée pour repérer l’activité antioxydante des Composés, sont relativement peu nombreuses et font intervenir en général, la coloration ou la décoloration d’un réactif spécifique en présence d’agents antioxydants.
5.1. Evaluation de l’activité antioxydante par CCM :
Dépistage de l’activité antioxydante sur CCM à l’aide du DPPH : le test chimique que nous avons utilisé pour déceler la présence de composés antioxydants dans les extraits de plante repose sur le principe de la réduction des radicaux libres fournis par le 1, 1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH). Pour réaliser ce test, nous avons déposé 10 µ L d’une solution de 10 mg/mL (M/V) de chaque extrait sur la plaque de silicagel 60 F254 (Merck) possédant un support en aluminium. Le développement des plaques a été réalisé dans les systèmes de solvants suivants:
Butanol-Acétate d’éthyle-Eau (65 : 15 : 25) pour les extraits polaires, tandis que les extraits apolaires ont été développés dans le système de solvants éther-acétate d’éthyle (50 : 50). Après migration, les chromatogrammes ont été séchés à l’aide du séchoir électrique puis révélés à l’aide d’une solution de DPPH à la concentration de 2 mg / mL (M / V) dans le méthanol. En présence de substances antioxydantes, le DPPH est réduit et passe de la couleur pourpre au jaune.
Sur les plaques CCM, les zones d’activités antiradicalaires apparaissent en jaune-clair sur fond violet après un temps optimal de 30 mn [53] .
La plupart des méthodes sont basées sur l’utilisation des systèmes générant des radicaux très variés. Ce sont principalement des méthodes dites "d’inhibition " dans lesquelles une espèce chimique capable de générer des radicaux libres est utilisée avec une substance capable de détecter ces espèces.
L’échantillon dont on souhaite mesurer le pouvoir antioxydant est capable d’inhiber la génération des radicaux.
Compte tenu de la complexité des processus d’oxydation, il n’existe pas de méthode unique qui permettrait de refléter le profil antioxydant d’un échantillon. C’est pourquoi, on effectue différents tests de mesure de pouvoir antioxydant.
Les tests basés sur le transfert d’un atome d’hydrogène (HAT, Hydrogen Atom Transfer), dans lequell’antioxydant et le substrat sont en compétition pour les radicaux peroxyles ROO●:
ROO● + AH―› ROOH + A●
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Il existe de nombreuses méthodes de mesure de l’activité antioxydante :
5.2. Piégeage du radical libre DPPH (2, 2-Diphényl-1-Picrylhydrazyle) :
Pour étudier l’activité antiradicalaire des différents extraits, nous avons opté pour la méthode qui utilise le DPPH comme un radical libre relativement stable qui absorbe dans le visible à la longueur d’onde de 515 à 520 nm.
Le test consiste à mettre le radical DPPH (de couleur violette), en présence des molécules dites antioxydantes afin de mesurer leur capacité à le réduire. La forme réduite (diphényl picryl-hydrazine : de couleur jaune) n’absorbe plus à 517 nm, ce qui se traduit par une diminution de l’absorbance [54].
5.2.1. Mode opératoire :
Selon le protocole décrit par SANCHEZ-MORENO [55]. La solution de DPPH est préparée par solubilisation de 2,4 mg de DPPH dans 100 mL de méthanol (6x10-5 M). 50 µl des solutions d’huile ou standard (acide ascorbique) sont ajoutés à 950 µL de DPPH, le mélange est laissé à l’obscurité pendant 30 min et la décoloration par rapport au contrôle négatif contenant la solution de DPPH et du méthanol est mesurée à 517 nm. L’activité antiradicalaire est estimée selon l’équation ci-dessous :
% d’activité radicalaire = (Abs contrôle-Abs échantillon) /Abs contrôle ×100
• Calcul des IC50 :
IC50 (concentration inhibitrice de 50 %), aussi appelée EC50 (Efficient concentration50), est la concentration de l’échantillon testé nécessaire pour réduire 50% de radical DPPH.
Les IC50 sont calculées graphiquement par des pourcentages d’inhibition en fonction de différentes concentrations des extraits testée [56] .
Figure 12 : Pourcentages de réduction du radical libre DPPH d’huile essentielle des
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Figure 13 : Pourcentages de réduction du radical libre DPPH d’huile essentielle de la partie
aérienne
N.B : Le BHT et l’acide ascorbique sont utilisées comme contrôle positif, dans les deux méthodes de l’évaluation de l’activité antioxydantes (DPPH et réduction du fer), et aux mêmes conditions expérimentales.
5.3. Réduction du fer: FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power) :
5.3.1. Principe :
La méthode est basée sur la réaction de réduction du Fe3+ présent dans le complexe ferrocyanure de potassium en Fe2+, la réaction est révélée par le virement de couleur jaune du fer ferrique (Fe3+) en couleur bleu vert du fer ferreux (Fe2+), l’intensité de cette coloration est mesuré par spectrophotométrie (Figure 14) à 700 nm.
Figure 14 : spectrophotomètre UV
5.3.2. Mode opératoire :
Cette méthode est déterminée en utilisant la technique d’Oyaizu [57]. Les différentes concentrations de l’extrait dans l’eau distillée (1 mL) sont mélangées avec 2.5 mL de la solution
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tampon phosphate (0.2 M, pH 6.6) et 2.5 mL de ferricyanure de potassium [K3Fe(CN)6] (1%). Les mélanges sont incubés à 50°C pendant 20 min. Après, 2.5 mL de l’acide trichloracétique (10%) est additionné. Le tout est centrifugé à 3000 tours pendant 10 min (Figure 14). A la fin, 2.5 mL du surnageant de chaque concentration est mélangé avec 2.5 mL de l’eau distillée et 0.5 mL de FeCl3, 6 H20 (0.1%). L’absorbance est mesurée à 700 nm. L’augmentation de l’absorbance dans le milieu réactionnel indique l’augmentation de la réduction de fer. L’acide ascorbique est utilisé comme contrôle positif.
Figure 15 : centrifugeuse : SIGMA
5.4. Test de blanchissement du β-carotène (β-carotène bleaching method) :
5.4.1. Principe :
L’activité antioxydante des huiles essentielles de Centaurea acaulis est mesurée selon la méthode de Tepe [58]. L’oxydation de l’acide linoléique génère des radicaux peroxydes, ces radicaux libres vont par la suite oxyder le β-carotène entrainant ainsi la disparition de sa couleur rouge, qui est suivie par spectrométrie à 470 nm. Cependant la présence d’un antioxydant pourrait neutraliser les radicaux libres dérivés de l’acide linoléique et donc prévenir l’oxydation et le blanchissement du β-carotène. Dans ce test la capacité antioxydante est déterminée en mesurant l’inhibition de la dégradation oxydative de β-carotène (décoloration) par les produits d’oxydation de l’acide linoléique [58].
5.4.2. Mode opératoire
Dissoudre 2 mg de β-carotène dans 1 mL de chloroforme. La solution obtenue est introduite dans un ballon contenant 2 mg d’acide linoléique et 200 mg de Tween 40. Après évaporation du
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chloroforme, 100 mL d’eau distillée saturée en oxygène sont ajoutés avec agitation vigoureuse. De cette nouvelle solution 2.5 mL sont transférés dans des tubes auxquels sont additionnés 350 µL de chaque huile à différents concentration.
Un tube contenant 2.5 mL d’émulsion et 350 µL d’éthanol servira de témoin négatif. L’absorbance est immédiatement mesurée à 470 nm, D’autres lectures sont faites à différents intervalles de temps (2h, 4h, 6h, 12h, et 48h) [58]. Toutes les mesures sont réalisées en triplicata.
L’activité anti-oxydante relative après 48 heures est calculée selon la relation suivante :
AAR = (Abs Échantillon/Abs BHT) x 100
Où :
-AAR : activité anti-oxydante relative.
-Abs Échantillon : absorbance de l’échantillon après 48 heures. -Abs BHT : absorbance du BHT après 48 heures.