L'idée initiale du projet décrit dans cette partie était de réguler de manière dynamique la croissance de nanofibres auto-assemblées en utilisant deux enzymes ayant des activités antagonistes. Un peptide précurseur contenant un pont disulfure a été préparé, conduisant à un hydrogélateur contenant un thiol lorsque la liaison SS est réduite. Le couple d'enzymes choisies était la glutathion réductase et la glutathion peroxydase capable de «casser» et de «reformer» le pont disulfure du peptide, respectivement. Les activités enzymatiques de ce couple peuvent à la fois assurer la formation des hydrogélateurs disponibles et la croissance / désassemblage des nanofibres obtenues (Figure 16).
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Figure 16: Schéma de la formation et de la dissociation des nanofibres auto-assemblée en présence du couple d’enzymes antagonistes.
Cependant, nous avons observé que lorsque le peptide précurseur contenant le pont disulfure est en présence de protéines catalytiquement non actives (expérience de contrôle négatif), un hydrogel se forme spontanément comme observé en présence de glutathion réductase. Ce résultat n'était pas attendu. Cela nous intriguait particulièrement et nous avons donc décidé de chercher plus loin pour répondre aux questions suivantes: quel est le mécanisme de ce nouveau type de processus d’auto-assemblage assisté par protéine? Quel est le rôle de la protéine dans l'initiation de l'auto-assemblage? Comment une protéine non catalytiquement active réduit-elle un pont disulfure?
Dans le chapitre 3 de ce manuscrit, je propose quelques réponses possibles à ces questions, en introduisant une nouvelle stratégie pour contrôler les processus d’auto-
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assemblage de manière spatio-temporel. Elle repose sur la présence simultanée de protéines possédant ou non une activité catalytique, de LMWH et son précurseur, tous deux en équilibre dynamique via une liaison réversible (ici une liaison disulfure). L'interaction du précurseur avec la protéine déclenche un processus d'auto-assemblage qui conduit à l'établissement d'un cycle auto-entretenu dans lequel une génération continue d'hydrogélateurs induite par le processus d'auto-assemblage lui-même. Cette approche semble étroitement liée au concept de la chimie dynamique combinatoire.
Le peptide utilisé est un peptide original, le Fmoc-GFFYE-NH- (CH2)2-SH, appelé
Fmoc-A-SH, inspiré de la littérature. Le groupe protecteur N-Fluorénylméthyloxycarbonyle
(Fmoc) a été ajouté à la position N-terminale pour améliorer la capacité de l'hydrogélateur correspondant Fmoc-A-SH à s'auto-assembler. Lorsque le groupe thiol de ce peptide est
protégé par un pont disulfure, le Fmoc-A-SS-B résultant (Fmoc-GFFYE-NH-(CH2)2-SS-
(CH2)2-NHCO-(CH2)2-CO-EE-OH) n'est pas capable de s'auto-assembler en raison de la
séquence B fortement chargée négativement. Lorsque 10 mg/mL (7,3 mmol) de Fmoc-A-
SS-B sont dissous dans du tampon PBS (pH 7,4) à 25 °C, aucune hydrogel ne se forme,
même après 48 heures, comme prévu. Les chromatogrammes de HPLC contrôlant la composition chimique de cette solution dans le temps montrent qu'un équilibre thermodynamique entre Fmoc-A-SS-B et Fmoc-A-SH est rapidement établi (moins de 2
minutes). À l'équilibre, 10% de Fmoc-A-SH sont présents et 90% de Fmoc-A-SS-B
constituent le composé principal. Bien entendu, Fmoc-A-SS-A-Fmoc et B-SS-B sont
également présents dans le mélange: Fmoc-A-SS-A-Fmoc est présent au niveau de trace
et B-SS-B n'est pas détectable par notre détecteur UV.
Pour obtenir un hydrogel supramoléculaire à partir d'une solution de Fmoc-A-SS-B
(10 mg/mL), le pont disulfure doit être réduit et la glutathion réductase (GR, 1 mg/mL) a été choisie pour jouer ce rôle. Étant donné que l’initiation de la formation de l’hydrogel devrait
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dépendre de la production suffisante de Fmoc-A-SH (pour atteindre sa concentration
critique de gélation), nous avons suivi sa formation par HPLC dès l’introduction de GR dans le flacon. La formation de l’hydrogel est qualitativement observée par un simple test d'inversion de flacon. Fmoc-A-SS-B disparaît au cours des premières minutes et
corrélativement la formation de Fmoc-A-SH est observée. Environ deux minutes après l'addition de GR, il se forme 100% de l'hydrogélateur Fmoc-A-SH et on obtient un gel
possédant un module d'élasticité G0 proche de 1 kPa.
Pour démontrer le rôle catalytique de l’enzyme dans le processus de gélation, une autre enzyme incapable de scinder le pont disulfure du Fmoc-A-SS-B, la phosphatase
alcaline (AP), a été utilisée à la place de la protéine GR et la même étude par HPLC a été réalisée. Comme prévu, aucun gel ne s'est formé même 60 minutes après l'addition de AP (1 mg/mL) dans la solution de Fmoc-A-SS-B (10 mg/mL). Cependant, le suivi par HPLC a
révélé la formation de Fmoc-A-SH, plus lentement qu'avec GR, mais atteignant néanmoins
une transformation chimique complète (à partir de Fmoc-A-SS-B) après une heure. Afin de
vérifier si ce résultat inattendu peut être étendu à d'autres protéines que l'AP, nous avons mis une solution de Fmoc-A-SS-B fraîchement préparée en contact avec de l’albumine
provenant de sérum bovin (BSA, 1 mg/mL). En dépit d'une cinétique plus lente de la formation de Fmoc-A-SH que de celle de l'AP, Fmoc-A-SS-B a finalement presque
complètement disparu au bout d'une heure, mesurée par HPLC, mais aucun gel ne s'est formé même 24 heures plus tard. La réduction plus rapide de Fmoc-A-SS-B catalysée par
GR étant peut-être impliquée dans l'efficacité du processus de gélation, 1 équivalent de l'agent réducteur (tris (2-carboxyéthyl) phosphine) (TCEP) a été ajouté à une solution de Fmoc-A-SS-B pour vérifier cette hypothèse: la HPLC met en évidence une conversion
complète instantanée en Fmoc-A-SH mais aucune gélation n'a été observée, même après
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quand 1 équivalent molaire de dithiothréitol (DTT) ou de glutathion (GSH) était utilisé à la place du TCEP sans formation de gel comme pour le TCEP. Le système a donc été étudié de manière plus approfondi et les résultats ainsi que l’hypothèse émise sur le mécanisme de l’auto-assemblage sont décrit en détails dans le chapitre 3.