La recherche des bases moléculaires de la localisation de FAS-II faisait partie intégrante du projet de thèse de K. Nukdee (doctorante 1ère année). Il était, notamment question de connaitre, par des approches génétiques l’implication de protéines du cycle bactérien (Wag31, FtsZ, Pbps) dans la localisation de FAS-II. Plusieurs tentatives de construction de mutant conditionnel du gène wag31 avaient été entreprises et avaient échouées. Ces échecs ont été attribués à des problèmes de complémentation inefficace par Wag31 lors de la construction de ces mutants. Le niveau d’expression de Wag31 au moment de la disruption du gène sauvage semble primordial.
III/ 1 Mise en œuvre du système TetR/Pip OFF
Au cours de mon travail de thèse, nous avons obtenu un système d’expression contrôlé développé par Boldrin et collaborateurs qui permet, en présence de tétracycline (Tc) ou d’anhydrotétracycline (AH-Tc), de réprimer l’expression d’un gène placé en aval du promoteur Pptr lui-même contrôlé par le répresseur Pip (Figure 41A). Les auteurs de cette étude ont également réalisé, grâce au vecteur suicide pFRA53, un système permettant la mutagenèse in
A
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Figure 41 : Schéma du mode de régulation du système TET/PIP ainsi que son application pour la réalisation de mutants chromosomiques (d’après Boldrin et al, 2010). (A) Modèle de fonctionnement du système TetR / Pip OFF. En l'absence de tétracycline (Tc), le répresseur TetR se lie à ses opérateurs pour éteindre la transcription du gène du répresseur Pip, permettant ainsi l'expression de lacZ. En présence de Tc, la transcription de pip est autorisée. En conséquence, Pip réprime l'expression de lacZ. (B) Le plasmide pFRA53 possède les 500 premières paires de bases du gène ftsZ de Msm placées en aval du promoteur Pptr. Ce plasmide ne possède pas d’origine de réplication pour les mycobactéries. Lors de la transformation de Msm puis de la sélection par l’Hygromycine (Hyg) l’établissement du plasmide permettant la résistance est réalisée par recombinaison homologue entre la séquence ftsZ du plasmide et celle du chromosome. L’insertion du plasmide induit la délétion d’une partie (3’) du gène chromosomique qui est sous le contrôle de son promoteur sauvage et la formation d’une copie intacte du gène placée alors sous le contrôle du promoteur Pptr. La présence du plasmide pFRA42 intégré au site att de Msm permet le fonctionnement du système TetR/Pip OFF, Cette construction permet donc d’inhiber l’expression de ftsZ en présence de Tc ou d’anhydro-tetracycline (AH-Tc),
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situ d’un gène chromosomique et la mise sous contrôle de Pip du gène sauvage complémentant (Figure 41B). Pour tester leur système les auteurs avaient réalisé la mise sous contrôle du gène ftsZ de Msm (Boldrin et al, 2010).
Nous avons tout d’abord testé les conditions d’utilisation de ce système grâce au gène rapporteur de la -galactosidase. Nous avons effectué le sous-clonage de la souche de Msm portant le plasmide pFRA42B sur différentes boites de Pétri contenant chacune une concentration différente de AH-Tc (25, 50, 100 et 150 ng/mL). Le milieu contenant du X-gal en concentration adaptée nous a permis d’observer la présence (coloration bleue) ou non (aucune coloration) de la beta galactosidase (résultats non montrés). Les colonies sous-clonées sur milieu contenant 25 et 50 ng/mL de AH-Tc montrent une coloration bleue plus intense pour les colonies de la boite contenant 25 ng/mL de AH-Tc. Contrairement à cela les colonies des boites possédant 100 et 150 ng/mL d’AH-Tc ne montrent aucune coloration. Le système semble donc totalement réprimé à 100 et 150 ng/mL d’AH-Tc. Par la suite nous avons réalisé l’ensemble des expériences avec ce système avec une concentration de 100ng/mL d’AH-Tc.
III/ 2 Etude du phénotype de filamentation du mutant conditionnel
ftsZ
Nous avons utilisé les constructions plasmidiques fournies par les auteurs pour construire une souche de Msm permettant en présence d’AH-Tc d’inhiber l’expression du gène ftsZ. L’obtention de ce mutant avait été réalisée par transformation et sélection (Hygromycine) du plasmide pFRA53 dans une souche portant le plasmide pFRA42B. Ceci permettant d’effectuer la mise sous contrôle du système TetR/Pip OFF du gène ftsZ sauvage complémentant la délétion produite par le système (Figure 41B). Nous avons ensuite effectué le sous-clonage de 4 colonies sur milieu de culture solide contenant ou non 100 ng/mL d’AH-Tc ainsi que d’une souche de Msm témoin. Les 4 colonies issues de la transformation du plasmide pFRA53 montrent une croissance normale sur milieu sans AH-Tc en comparaison avec la souche témoin. Contrairement à cela sur milieu contenant l’AH-Tc les mutants ne sont pas capables de former des colonies contrairement à la souche témoin. Cette observation est en adéquation avec le fait que le gène ftsZ soit essentiel.
L’observation en vidéomicroscopie du mutant conditionnel ftsZ en condition non permissive montre une augmentation importante de la taille des bactéries provoquée par l’incapacité de la cellule à former un septum de division (Film S17). La taille des cellules en fin de film est supérieure à 15 µm (Figure 42E,F,G,H,I et J), en comparaison Msm est décrit comme ayant une
Figure 42 : Observation au cours du temps de la croissance de Msm en condition ne permettant plus l’expression du gène ftsZ. En présence d’AH-Tc (100ng/µL), l’expression du gène ftsZ est réprimée provoquant l’apparition au cours du temps d’un phénotype de filamentation (panneau de gauche). En absence d’AH-Tc (panneau de droite) la souche exprime le gène ftsZ et la croissance est normale. Les images ont été extraites d’expériences de videomicroscopie et ont été obtenues en lumière transmise. L’échelle est indiquée en µm.
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taille moyenne de 3 à 5 µm (Hett & Rubin, 2008). De façon intéressante, nous avons pu observer la formation de branchements perpendiculaires à l’axe principal de la bactérie (Figure 42F,H,I et J) qui ne sont jamais observés sur la souche sauvage. Ce bourgeonnement est capable d’effectuer une croissance importante pour atteindre dans cet exemple représentatif, 6.8 µm de longueur, soit une taille supérieure à la taille moyenne de Msm. Cette souche semble donc bien posséder un phénotype mutant pour FtsZ, c’est-à-dire l’établissement au cours du temps d’un phénotype de filamentation (Dziadek et al, 2003). En comparaison, la même souche en absence d’AH-Tc, c’est-à-dire en présence de la protéine FtsZ sauvage, montre en vidéomicroscopie une élongation, une division, et une taille normales (Film S18). De plus, aucune cellule possédant une longueur supérieure ou égale à 10 µm n’a été observée. Le phénotype de filamentation semble donc bien dépendre ici uniquement de l’inhibition de l’expression du gène de ftsZ.
Afin de confirmer l’absence de septum dans les filaments nous avons utilisé le domaine MmpL3- N10 fusionné à la GFP comme marqueur du septum. Comme montré figure 43A, aucune fluorescence transversale à l’axe des filaments n’est observable dans la souche ftsZ en condition non-permissive (Film S19). Cela semble donc confirmer l’absence de figure de septation et l’absence de formation de l’anneau ftsZ permettant le recrutement de la membrane plasmique et donc de la fusion MmpL3-N10. Les cellules sont donc bien incapables d’initier la formation du divisome (Hett & Rubin, 2008) après quelques heures d’exposition à l’AH-Tc.
III/ 3 Localisation de MmpL3 en condition mutant pour FtsZ
La localisation de la fusion MmpL3-N10-GFP observée en condition ftsZ mutant était comparable à celle observée en condition sauvage, c’est-à-dire membranaire (Figure 9 ; article). La localisation du domaine MmpL3-N10 n’est donc pas affectée par la diminution de la concentration (déplétion) ou l’absence de FtsZ dans la bactérie. Nous avons voulu réaliser l’observation de la localisation de la fusion de MmpL3 complète avec la GFP en contexte mutant pour FtsZ. Ceci ne pouvait pas être effectué, comme les autres expériences étudiant MmpL3, dans la souche produisant la fusion mCherry-Wag31 à cause des incompatibilités de plasmides et de gènes de résistances. MmpL3-GFP, en condition ftsZ mutante possède une localisation membranaire. De plus, la concentration au niveau des membranes polaires est encore visible et, de façon plus intéressante, on remarque une fluorescence plus intense au niveau des pôles des branches (Figure 43B). De plus, on observe également une déformation importante de la forme de la cellule typique de l’expression de la fusion MmpL3 dans une souche ne surexprimant pas Wag31 (Film S20).
Figure 43 : Observation au cours du temps de la localisation de la fusion GFP de MmpL3 chez Msm en condition ne permettant plus l’expression du gène ftsZ. (A) Localisation de MmpL3-N10-GFP au sein de Msm induite par 0,2% acétamide et en condition mutante ftsZ (100ng/µL AH-Tc). (B) Localisation de MmpL3-GFP complète dans les mêmes conditions. Les images obtenues en lumière transmise (colonne gauche) ou sur le canal GFP (colonne droite) sont présentées.
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Ces résultats de localisation du domaine MmpL3-N10 et MmpL3 sauvage en condition FtsZ mutante ne permettaient pas d’effectuer une quantification de la fluorescence polaire et latérale du fait du nombre trop réduit de bactéries observées à ce jour et de la toxicité générée par MmpL3-GFP complète. Cependant, il semble bien qu’en absence de FtsZ, des pôles soient créés pour la formation des branches et que MmpL3 s’accumule aussi bien à ces pôles qu’aux pôles « normaux » de la bactérie. Ce résultat indique un phénomène de localisation actif à un nouveau site de croissance et non dans l’axe principal de la bactérie. Cela confirme que la localisation de MmpL3 aux pôles de la bactérie est un phénomène physiologique et non un phénomène d’accumulation non spécifique.
III/ 4 Localisation de MmpL3 en condition mutante pour Wag31 Afin d’étudier le rôle potentiel de Wag31 dans la localisation de FAS-II et de MmpL3 K. Nukdee et moi-même avons effectué la construction d’une souche de Msm mutant conditionnel de wag31 dans laquelle le gène sauvage wag31 est sous contrôle du système TetR/Pip OFF. Ce système a permis d’obtenir facilement cette souche contrairement aux multiples essais effectués auparavant avec les systèmes « classiques » d’échange allélique mis en place par exemple dans le cas de la délétion du gène kasB. Pour permettre une visualisation plus facile du phénotype, nous avons également réalisé l’observation en vidéomicroscopie de l’apparition du phénotype dans une souche de Msm exprimant la GFP afin de marquer le cytoplasme des bactéries. Dans cette souche, l’inhibition de l’expression du gène wag31 provoque rapidement une déformation progressive des bactéries, généralement au niveau d’un pôle pour donner des bactéries en forme d’ampoule. Puis, la déformation de la cellule s’étend à l’autre pôle jusqu’à former une cellule totalement ronde qui lyse rapidement (Film S21). Ces résultats sont totalement en accord avec les résultats de Kang et collaborateurs obtenus avec un mutant conditionnel wag31 (Kang et al, 2008). Comme précédemment le phénotype observé est uniquement dépendant de l’inhibition de l’expression du gène wag31 comme le montre la division normale de la même souche en absence d’AH-Tc. La forme des cellules non induites est également de type sauvage et ne présentent pas de lyse apparente. A ce jour, l’observation en absence d’AH-Tc a été réalisée uniquement dans une souche n’expriment pas la GFP (Film S22).
Nous avons réalisé l’expression de MmpL3 sauvage en fusion avec la GFP dans le mutant conditionnel wag31. L’observation en vidéomicroscopie nous a permis, en condition non permissive, de mettre en avant l’arrondissement des cellules typiques d’un mutant Wag31 ainsi qu’une localisation altérée de la fusion complète MmpL3-GFP (Film S23). Cependant la toxicité à
Figure 44 : Observation au cours du temps de la localisation de fusion GFP de Mmpl3 chez Msm en condition ne permettant plus l’expression du gène Wag31. Les images extraites
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la fois de la déplétion en Wag31 et de la présence de la fusion MmpL3 provoquait une lyse très rapide des bactéries. Cela rendait très complexe l’étude statistique de la localisation de MmpL3 dans cette souche. La construction d’un système génétique pouvant pallier ce problème a été entreprise (P. Thevenot ; stagiaire BTS).
Ces résultats bien que très préliminaires semblent indiquer que la localisation polaire de MmpL3 soit affectée dans le mutant conditionnel wag31. En effet, lorsque les cellules sont arrondies (signe d’une diminution très importante de la quantité de Wag31) il semble que la fusion MmpL3 soit localisée de façon uniforme au niveau de la membrane plasmique (Figure 44). Cette observation est le premier indice de l’existence d’une interaction fonctionnelle entre Wag31 et un acteur de la biosynthèse des AM. Il ouvre la voie vers l’étude de la relation entre le cycle bactérien et la biosynthèse des lipides majeurs de l’enveloppe que sont les AM.