Figure 69. Analyse des génomes de M. pneumoniae M129 délétés pour les gènes mpn142-143 et mpn398-400, obtenus par
CReasPy-cloning.(A) Vérification par PCR de la délétion Δmpn142-143. La présence du génome de M. pneumoniae dans la levure
et le remplacement du gène cible a été vérifié par PCR. L’utilisation d’amorces spécifiques de M. pneumoniae et encadrant le gène
cible permet l’amplification d’un fragment de 2935 pb. Une amplification de 4598 pb est attendue pour les clones sauvages, profil
identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 1 kb Plus (Invitrogen) ; +, ADNg de M. pneumoniae M129 ; -, contrôle
négatif sans ADN. (B) Vérification par PCR de la délétion Δmpn398-400. L’utilisation d’amorces spécifiques de M. pneumoniae et
encadrant le gène cible permet l’amplification d’un fragment de 610 pb. Une amplification de 4048 pb est attendue pour les clones
sauvages, profil identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 1 kb Plus (Invitrogen) ; +, ADNg de M. pneumoniae
M129 ; -, contrôle négatif sans ADN. (C) Vérification par PCR multiplex de l’intégrité des génomes. Deux jeux d’amorces ont été
utilisés (le jeu 1 et le jeu 2). Chaque jeu est composé de dix paires d’amorces permettant l’amplification de loci répartis de manière
homogène sur le génome de M. pneumoniae, permettant l’amplification simultanée de dix fragments de 100 à 1000 pb (jeu 1) et
de 125 à 1025 pb (jeu 2), avec 100 pb d’incrément. Les clones contenant le génome de M. pneumoniae sans réarrangement majeur
présentent un profil de dix bandes identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 100 pb (Promega) ; +, ADNg de M.
pneumoniae M129 ; -, contrôle négatif sans ADN.
Figure 70. Analyse des génomes de M. pneumoniae M129 délétés pour les gènes mpn372, mpn142 et mpn400, obtenus par
CReasPy-cloning.(A) Vérification par PCR de la délétion Δmpn372. La présence du génome de M. pneumoniae dans la levure et le
remplacement du gène cible a été vérifié par PCR. L’utilisation d’amorces spécifiques de M. pneumoniae et encadrant le gène cible
permet l’amplification d’un fragment de 3118 pb. Une amplification de 2020 pb est attendue pour les clones sauvages, profil
identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 1 kb Plus (Invitrogen) ; +, ADNg de M. pneumoniae M129 ; -, contrôle
négatif sans ADN. (B) Vérification par PCR de la délétion Δmpn142. L’utilisation d’amorces spécifiques de M. pneumoniae et
encadrant le gène cible permet l’amplification d’un fragment de 965 pb. Une amplification de 4598 pb est attendue pour les clones
sauvages, profil identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 1 kb Plus (Invitrogen) ; +, ADNg de M. pneumoniae
M129 ; -, contrôle négatif sans ADN. (C) Vérification par PCR de la délétion Δmpn400. L’utilisation d’amorces spécifiques de M.
pneumoniaeet encadrant le gène cible permet l’amplification d’un fragment de 2156 pb. Une amplification de 4048 pb est
attendue pour les clones sauvages, profil identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 1 kb Plus (Invitrogen) ; +,
ADNg de M. pneumoniae M129 ; -, contrôle négatif sans ADN. (D) Vérification par PCR multiplex de l’intégrité des génomes. Deux
jeux d’amorces ont été utilisés (le jeu 1 et le jeu 2). Chaque jeu est composé de dix paires d’amorces permettant l’amplification
de loci répartis de manière homogène sur le génome de M. pneumoniae, permettant l’amplification simultanée de dix fragments
de 100 à 1000 pb (jeu 1) et de 125 à 1025 pb (jeu 2), avec 100 pb d’incrément. Les clones contenant le génome de M. pneumoniae
sans réarrangement majeur présentent un profil de dix bandes identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 100 pb
(Promega) ; +, ADNg de M. pneumoniae M129 ; -, contrôle négatif sans ADN.
Figure 71. Analyse des génomes de M. pneumoniae M129 délétés pour les gènes mpn372, mpn142-143 et mpn398-400, obtenus
par CReasPy-cloning.(A) Vérification par PCR de la délétion Δmpn372. La présence du génome de M. pneumoniae dans la levure
et le remplacement du gène cible a été vérifié par PCR. L’utilisation d’amorces spécifiques de M. pneumoniae et encadrant le gène
cible permet l’amplification d’un fragment de 3118 pb. Une amplification de 2020 pb est attendue pour les clones sauvages, profil
identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 1 kb Plus (Invitrogen) ; +, ADNg de M. pneumoniae M129 ; -, contrôle
négatif sans ADN. (B) Vérification par PCR de la délétion Δmpn142-143. L’utilisation d’amorces spécifiques de M. pneumoniae et
encadrant le gène cible permet l’amplification d’un fragment de 228 pb. Une amplification de 4598 pb est attendue pour les clones
sauvages, profil identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 1 kb Plus (Invitrogen) ; +, ADNg de M. pneumoniae
M129 ; -, contrôle négatif sans ADN. (C) Vérification par PCR de la délétion Δmpn398-400. L’utilisation d’amorces spécifiques de
M. pneumoniaeet encadrant le gène cible permet l’amplification d’un fragment de 610 pb. Une amplification de 4048 pb est
attendue pour les clones sauvages, profil identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 1 kb Plus (Invitrogen) ; +,
ADNg de M. pneumoniae M129 ; -, contrôle négatif sans ADN. (D) Vérification par PCR multiplex de l’intégrité des génomes. Deux
jeux d’amorces ont été utilisés (le jeu 1 et le jeu 2). Chaque jeu est composé de dix paires d’amorces permettant l’amplification
de loci répartis de manière homogène sur le génome de M. pneumoniae, permettant l’amplification simultanée de dix fragments
de 100 à 1000 pb (jeu 1) et de 125 à 1025 pb (jeu 2), avec 100 pb d’incrément. Les clones contenant le génome de M. pneumoniae
sans réarrangement majeur présentent un profil de dix bandes identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 100 pb
(Promega) ; +, ADNg de M. pneumoniae M129 ; -, contrôle négatif sans ADN.
Figure 72. Vérification par PFGE de la taille des génomes de M. pneumoniae M129 clonés dans la levure avec la stratégie
CReasPy-cloning.Les génomes bactériens ont été digérés avec l’enzyme de restriction NotI. Le profil attendu est composé de deux
fragments de 711 kpb et 105 kpb. M, marqueur de taille « Yeast Chromosome PFG Marker » (NEB) ; Sc, S. cerevisiae VL6-48N ; +,
Figure 73.Schéma illustrant le protocole de CReasPy-cloning in vitro. Au départ, les cellules sont emprisonnées dans des blocs
d'agarose. Elles sont digérées afin d’obtenir obtenir un ADN nu inclus dans des blocs d'agarose. L'ADN est ensuite incubé in
vitroen présence de la Cas9 et d’un ARNg. L'ADN ainsi digéré et un pansement de recombinaison sont co-transformés dans la
levure, ce qui induit la réparation du génome de M. pneumoniae par le système de recombinaison homologue hautement
efficace de la levure.
Figure 74. Analyse des génomes de M. pneumoniae M129 délétés pour le gène mpn400, clonés dans la levure avec la stratégie
CReasPy-cloning in vitro.(A) La présence du génome de M. pneumoniae dans la levure et le remplacement du gène cible ont été
vérifiés par PCR. L’utilisation d’amorces spécifiques de M. pneumoniae et encadrant le gène cible permet l’amplification d’un
fragment de 4314 pb. Une amplification de 3480 pb est attendue pour les clones sauvages, profil identique à celui du contrôle
positif. M, Marqueur de taille 1 kb Plus (Invitrogen) ; +, ADNg de M. pneumoniae M129 ; -, contrôle négatif sans ADN. (B)
Vérification par PCR multiplex de l’intégrité des génomes de M. pneumoniaeM129 clonés dans la levure. Deux jeux d’amorces ont
été utilisés (le jeu 1 et le jeu 2). Chaque jeu est composé de dix paires d’amorces permettant d’amplifier des loci répartis de
manière homogène sur le génome de M. pneumoniae, permettant l’amplification simultanée de dix fragments de 100 à 1000 pb
(jeu 1) et de 125 à 1025 pb (jeu 2), avec 100 pb d’incrément. Les clones contenant le génome de M. pneumoniae sans
réarrangement majeur présentent un profil de dix bandes identique à celui du contrôle positif. M, Marqueur de taille 100 pb
(Promega) ; +, ADNg de M. pneumoniae M129 ; -, contrôle négatif sans ADN. (C) Vérification par PFGE de la taille des génomes de
M. pneumoniae M129 clonés dans la levure.Les génomes bactériens ont été digérés avec l’enzyme de restriction NotI. Le profil
attendu est composé de deux fragments de 711 kpb et 105 kpb. M, marqueur de taille « Yeast Chromosome PFG Marker » (NEB)
; Sc, S. cerevisiae VL6-48N ; +, M. pneumoniae M129.
2. 3. CReasPy-cloning in vitro
Nous nous sommes intéressés au clivage in vitro du chromosome bactérien en
CReasPy-cloning pour différentes raisons. En effet, cette approche permettrait : (1) de réduire
Dans le document
Construction d’un châssis bactérien viable, minimal et non pathogène grâce aux outils de biologie de synthèse
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