Justifications

Nous  souhaitions  évaluer  l’efficacité  de  différents  protocoles  d’antibiothérapie  dans  un  modèle murin d’infection de matériel vasculaire. La question des modalités d’administration  des  différents  antibiotiques  choisis  se  posait  donc,  notamment  pour  la  cloxacilline.  Il  s’agit  en  effet  du  traitement  de  référence  des  infections  graves  à  staphylocoques  sensibles  à  la  méticilline50,  123‐125

.  Son  activité  antibactérienne  est  dite  « temps‐dépendante » :  elle  est  corrélée  à  la  durée  d’exposition  à  la  molécule.  Sa  demi‐vie  d’élimination  chez  l’homme  est  courte, de l’ordre de 45 minutes à 1 heure chez des patients à la fonction rénale normale. 

Tout  ceci  concourt  à  la  nécessité  d’administrations  pluriquotidiennes  voire  de  perfusions  continues en pratique clinique humaine. 

L’administration  parentérale  d’antibiotique  pluriquotidienne  n’est  pas  sans  poser  de  problèmes  chez  la  souris,  d’autant  que  les  demi‐vies  d’élimination  des  molécules  administrées  chez  cet  animal  sont  souvent  plus  brèves  que  chez  l’homme.  Plusieurs  protocoles d’administration des pénicillines du groupe M sont retrouvés dans la littérature. 

Domenech et al., dans un modèle de péritonite chez la souris (C57BL/6) traitée seulement 24  heures,  considèrent que la cloxacilline doit être administrée toutes les 2 heures¹²⁶. D’autres  auteurs,  à  l’inverse,  ne  préconisent  qu’une  injection  journalière  d’oxacilline  (souris  Balb/c,  modèle  d’infection  de  cuisse)¹²⁷,  de  cloxacilline  (souris  Swissneutropénique,  modèle  d’infection  de  cuisse)¹²⁸,  ou  de  dicloxacilline  (souris  NMRI,  modèle  de  péritonite)¹²⁹.  Enfin,  une équipe préconise d’utiliser de la dicloxacillin (même si « oxacillin » apparaît dans le titre  de  l’article)  en  deux  injections  par  jour  (infection  de  cuisse  chez  la  souris  Balb/c  neutropénique)¹³⁰. 

Pour  des  raisons  techniques  évidentes,  il  est  impossible  de  réaliser  des  perfusions  continues  dans  les  modèles  murins.  L’administration  itérative  (toutes  les  2  heures !)  pose  des  soucis  dans  un  modèle  comme  le  nôtre  dans  lequel,  comme  on  le  verra  plus  loin,  le  traitement  antibiotique  est  poursuivi  48  heures.  Cela  reviendrait  à  24  injections  d’antibiotique  par  souris,  ce  qui  pour  des  raisons  éthiques  et  de  réussite  de  l’expérimentation, serait impossible à réaliser. Une possibilité, aurait pu être l’utilisation de 

cette  molécule  n’étant  pas  le  traitement  choix  des  infections  sévères  à  staphylocoque¹³¹.  Notre idée a donc été d’augmenter la durée d’exposition à la cloxacilline après une injection,  soit  en  créant  une  insuffisance  rénale  chez  la  souris,  soit  en  interférant  avec  l’excrétion  tubulaire  de  la  cloxacilline  par  utilisation  du  probénecide.  Ces  deux  possibilités  ont  été  évaluées  en  mesurant  les  résultats  pharmacologiques  obtenus  après  une  injection  de  cloxacilline. 

 

2.2.2. Matériels et méthodes  Modèle d’insuffisance rénale chez la souris 

Les  animaux  utilisés  sont  de  nouveau  des  souris  Swiss  femelles  âgées  de  4  semaines,  pesant  20‐24g.  L’insuffisance  rénale  est  induite  par  une  injection  intra‐péritonéale  d’acide  folique  à  la  posologie  de  250  mg/kg  dilué  dans  une  solution  de  bicarbonate  de  sodium  à  0,3M dans un volume total de 0,5 mL par souris. Cette injection est connue pour provoquer  une  insuffisance  rénale  tubulaire  chez  la  souris,  débutant  dès  la  24^ème  heure  après  l’injection,  étant  maximale  à  24  heures  et  persistant  environ  7  jours  avant  qu’une  récupération  ne  commence  à  survenir^132‐134.  Vingt‐huit  souris  ont  été  utilisées  pour  les  expériences réalisées en duplicate. La réalité de l’insuffisance rénale est vérifiée par dosage  de la créatinine plasmatique chez la souris à la fois chez une souris témoin (n’ayant pas reçu  d’acide folique) et chez une souris traitée (méthode enzymatique Cobas/Roche^®). 

Soixante douze heures après l’injection d’acide folique, un traitement par cloxacilline est  administré  à  la  posologie  de  80  mg/kg  par  injection  sous‐cutanée.  Des  prélèvements  sanguins par ponction intracardiaque sont réalisés à 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 3 et 4 heures après  cette  injection.  Deux  souris  sont  utilisées  à  chaque  prélèvement,  réalisé  sous  anesthésie  (Isoflurane).  Les  souris  prélevées  sont  ensuite  euthanasiées  encore  endormies  par  dislocation cervicale. Le sang, placé dans un microtube contenant 0,4 μL d’héparine à 25 000  UI/5mL  pour  1  mL  de  sang,  est  centrifugé  à  5000  tours/min  pendant  10  minutes  à  4°C.  Le  plasma est alors prélevé. 

Les  dosages  plasmatiques  sont  effectués  grâce  à  la  méthode  de  diffusion  des  antibiotiques en milieu gélosé : une gamme de concentration de cloxacilline, en progression 

géométrique  de  raison  2,  entre  0,5  et  256  mg/L,  est  distribuée  dans  les  puits  d’une  gélose  AM2  (Antibiotique  Medium),  ensemencée  avec  la  bactérie  indicatrice Bacillus  subtilis.  Les  échantillons à doser sont déposés parallèlement à cette gamme étalon. Après incubation de  24  heures  à  37°C,  la  droite  de  régression  entre  le  logarithme  des  concentrations  de  la  gamme  et  les  diamètres  d’inhibition  correspondants  est  construite.  Les  diamètres  obtenus  avec  les  échantillons  à  doser  sont  ensuite  reportés  sur  la  droite  permettant  de  calculer  la  concentration  correspondante.  Le  seuil  de  détection  est  de  0,5  mg/L.  Les  coefficients  de  variation  intra  et  inter‐expérimentation  sont  inférieurs  à  5%¹³⁵.  Un  exemple  de  droite  de  corrélation obtenue pour la mesure de concentration de cloxacilline est fourni dans la figure  9. 

 

Modèle utilisant le probénecide 

On  utilise  de  nouveau  28  souris  de  même  type.  Le  probénecide  (Sigma‐Aldrich^®,  Saint‐

Quentin Fallavier, France) est administré à la souris à la posologie de 70 mg/kg (dilué pour  obtenir  une  solution  de  0,5  mL  dans  du  bicarbonate  de  sodium)  en  intrapéritonéal¹³⁶,  une  heure  avant  l’administration  de  cloxacilline  (80  mg/kg).  Des  prélèvements  sanguins  et  les  dosages  pharmacologiques  sont  réalisés  de  manière  parfaitement  identique  à  ce  qui  a  été  fait pour l’acide folique. 

Trente  souris  seront  ensuite  utilisées  dans  cette  partie  pour  comparer  l’efficacité  de  la  cloxacilline  seule  à  celle  de  la  cloxacilline  associée  au  probénecide  dans  notre  modèle  d’infection  de  matériel  vasculaire  selon  les  mêmes  modalités  du  modèle  final  qui  sera  détaillé  dans  la  partie  suivante.  Brièvement  et  spécifiquement  pour  cette  comparaison,  le  Dacron^®  implanté  chez  les  souris  est  infecté  par  un  inoculum  de  SAMS  27  217  (0,2  mL  de  solution  de  sérum  physiologique  contenant  10⁷ S.  aureus)  selon  les  mêmes  modalités  que  celles décrites précédemment. Deux jours plus tard, le traitement par cloxacilline est débuté  à  la  posologie  de  200  mg/kg/12  heures  en  injection  sous‐cutanée,  associée  ou  non  au  probénecide. Les souris sont réparties comme suit : 5 souris témoins (non traitées), 5 souris  traitées  par  cloxacilline  seule,  5  souris  traitées  par  cloxacilline  et  probénecide.  Cette  expérience est réalisée deux fois. Après 48 heures de ce traitement, le Dacron^® est explanté, 

ainsi  que  la  rate  pour  mise  en  culture  et  compte  bactérien  (même  procédure  que  précédemment). Le plan d’expérimentation est fourni dans la figure 13, page 86. 

Les  résultats  sont  comparés  par  le  logiciel  GraphPadprism  (version  6.0;  GraphPad  Software, San Diego, CA, USA). Une analyse de variance ANOVA est réalisée pour comparer  les  effets  entre  les  différents  groupes,  suivie  par  un  test  de  Bonferroni  pour  comparer  les  groupes deux à deux. Une valeur de P< 0,05 est considérée comme significative. 

   

y = 5,0632ln(x) + 6,7321 

Diamètre = 5,0632Ln (concentration) + 6,7321 Donc : concentration (mg/L) = e((diamètre-6,7321)/5,0632)

Diamètre d’inhibition (mm) 

Concentration (mg/L) 

2.2.3. Résultats  Modèle d’insuffisance rénale 

Ce modèle est pourvoyeur de mortalité importante de 30%. La dégradation de la fonction  rénale des souris est finalement assez modérée puisque la créatinine plasmatique passe de  17 μmol/L (+/‐ 2) avant injection d’acide folique à 31 μmol/L (+/‐ 4) après. 

Pour  autant,  cette  injection  entraîne  une  augmentation  très  importante  du  pic  de  cloxacilline  passant,  en  moyenne,  de  28,27  mg/l  pour  la  cloxacilline  seule  à  250  mg/L  chez  les souris ayant reçu de l’acide folique (figure 10a). L’aire sous la courbe est en conséquence  largement plus importante après injection d’acide folique : 286,9 vs 22. La demi‐vie n’est par  contre pas réellement allongée. 

 

Modèle utilisant le probénecide 

Aucune  mortalité  n’est  constatée  dans  ce  modèle.  Là‐aussi,  le  pic  est  largement  augmenté, passant en moyenne, de 28,27 mg/L à 112,84 mg/L, même si cette augmentation  est moins marquée qu’avec l’acide folique. L’aire sous la courbe est plus importante : 167,7  vs  21,08.  Là  encore  la  demi‐vie  n’est  pas  le  paramètre  pharmacocinétique  le  plus  impacté  (figure 10b). 

Les résultats d’analyse comparée de l’efficacité de la cloxacilline seule et de la cloxacilline  associée  au  probénecide  sont  décevants.  Ces  efficacités  sont,  en  effet,  très  similaires  voire  moins  bonnes  avec  le  probénecide  puisqu’on  retrouve  une  diminution  de  –  1,17  log₁₀  UFC/cm²  pour  la  cloxacilline  seule  et  ‐0,7  log10  UFC/cm² lorsqu’elle  est  associée  au  probénecide  (P>  0,05)  en  sachant  que  les  comptes  bactériens  retrouvés  pour  les  souris  contrôles étaient de 6,65 log₁₀ UFC/cm². 

 

En  conclusion,  le  modèle  comportant  de  l’acide  folique  est  abandonné  du  fait  d’une  mortalité  trop  importante  et  de  résultats  peu  convaincants.  Le  modèle  avec  injection  de  probénecide est lui aussi arrêté du fait de résultats très décevants. La cloxacilline sera donc  injectée seule dans les expérimentations suivantes.   

0 

Concentration en cloxacilline (mg/L)

Probénécide + Cloxacilline Cloxacilline seule

1   

2.3. Efficacité  comparée  de  différents  antibiotiques  dans  le  modèle  2 

d’infection de matériel vasculaire à Staphylococcus aureus  3 

Cette  partie  a  été  l’objet  de  la  rédaction  d’article  soumis  au Journal  of  Antimicrobial  4 

Chemotherapy (JAC) et  actuellement  en  cours  de  révision.  Pour  éviter  les  répétitions,  cet  5 

article tel qu’il a été soumis pour publication sera présenté dans les pages suivantes (pages  6 

60 à 83) et seuls les éléments n’apparaissant pas dans l’article seront rajoutés. 

7 

La bibliographie de l’article soumis a été actualisée lors de l’intégration du texte au reste  8 

de ce mémoire. Elle a été intégrée à la bibliographie générale de la thèse. Les appels dans le  9 

texte n’ont donc plus les mêmes valeurs que celles de la soumission. 

10 

   

11 

Title page 12 

13 

New in vitro and in vivo Models to evaluate Antibiotic Efficacy in Staphylococcus aureus 14 

Prosthetic Vascular Graft Infection 15 

16 

M. Revest^1,2,3, C. Jacqueline¹, R. Boudjemaa⁴, J. Caillon¹, V. Le Mabecque¹, A. Breteche¹, K.

17 

Steenkeste⁴, P. Tattevin^2,3, G. Potel¹, C. Michelet^2,3, MP. Fontaine-Aupart⁴, D. Boutoille^1,5 18 

19  20 

1Université Nantes, Faculté de Médecine EA3826 Nantes, France 21 

2CHU Rennes Infectious Diseases and Intensive Care Unit, Pontchaillou Hospital, 35033 22 

Rennes Cedex, France 23 

3 CIC Inserm 1414, Rennes 1 University, Pontchaillou Hospital, 35033 Rennes Cedex, France 24 

4Institut des Sciences Moléculaires Orsay, CNRS, Université Paris-Sud France 25 

5 CHU Nantes, Infectious Diseases Unit, Hôtel Dieu, Nantes, France 26 

27 

Corresponding author:

28 

Dr Matthieu Revest, 29 

CHU Rennes Infectious Diseases and Intensive Care Unit, Pontchaillou Hospital, 35033 30 

Rennes Cedex, France 31 

Running title: evaluation of different antibiotics for vascular prosthesis infections treatment 36 

37 

Key words: Staphylococcus aureus, animal models, biofilm, surgical infection, vascular 38 

prosthesis infections 39 

New in vitro and in vivo Models to evaluate Antibiotic Efficacy in Staphylococcus aureus 40 

Prosthetic Vascular Graft Infection 41 

42 

M. Revest^1,2,3, C. Jacqueline¹, R. Boudjemaa⁴, J. Caillon¹, V. Le Mabecque¹, A. Breteche¹, K.

43 

Steenkeste⁴, P. Tattevin^2,3, G. Potel¹, C. Michelet^2,3, MP. Fontaine-Aupart⁴, D. Boutoille^1,5 44 

45  1

Université Nantes, Faculté de Médecine EA3826 Nantes, France 46 

2CHU Rennes Infectious Diseases and Intensive Care Unit, Pontchaillou Hospital, 35033 47 

Rennes Cedex, France 48 

3 CIC Inserm 1414, Rennes 1 University, Pontchaillou Hospital, 35033 Rennes Cedex, France 49 

4Institut des Sciences Moléculaires Orsay, CNRS, Université Paris-Sud France 50 

5 CHU Nantes, Infectious Diseases Unit, Hôtel Dieu, Nantes, France 51 

approximately 50 000 in France.² Prosthetic vascular graft infections (PVGIs) are among the 55 

most serious complications associated with these procedures.³ Their frequency is estimated to 56 

undergo leg amputation.⁴¹Staphylococcus aureus is the most commonly causative organism 60 

and methicillin resistant S. aureus (MRSA) account for almost 50% of S. aureus PVGIs in 61 

North America.⁶⁰Clinical data regarding the optimal antibiotic therapy for these infections are 62 

scarce, in the absence of any comparative clinicaltrial dealing with PVGIs treatment and 63 

current recommendations for treatment of PVGIs are only based on expert opinion.¹³⁷ Hence, 64 

experimental data are needed to better identify the optimal antibiotic regimens for PVGIs.

65 

Like any other indwelling material infections, biofilm developed onto the vascular prosthesis 66 

plays a significant role in the difficulties encountered for treating PVGIs. Firstly, biofilm acts 67 

as a mechanical barrier against antibiotic penetration. Secondly, bacteria embedded in a 68 

mature biofilm enter in an altered metabolic state associated with a dramatic decrease of 69 

susceptibility to most antibiotics.^{90, 92} Many studies showed that minimal biofilm inhibitory 70 

concentrations (MBIC) and minimal biofilm eradicating concentrations (MBEC) of 71 

antibiotics are much higher than minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum 72 

bactericidal concentration (MBC) measured on planktonic bacteria.^138-140 However, most 73 

studies evaluated antibiotics efficacy on artificial materials not used in clinical practice, 74 

although the nature of the material may influence these results. In addition, although helpful, 75 

in vitro data may fail to capture what happens in vivo. Specific animal models of PVGIs exist 76 

but have mainly been used to evaluate techniques to prevent PVGIs,^141-144 and an animal 77 

model assessing the efficacy of different antibiotics regimen on infection of a Dacron^® 78 

vascular prosthesis used in clinical daily practice has not been described so far.

79 

In this study, we investigated the activities of cloxacillin, vancomycin, daptomycin and 80 

rifampicin against different strains of methicillin-susceptible S. aureus (MSSA) and MRSA in 81 

vitro. Those activities were determined against planktonic bacteria (MIC and MBC), and 82 

against adherent bacteria (MBIC and MBEC). To evaluate whether the nature of the support 83 

influence results for MBIC and MBEC, two different techniques were used: a largely used 84 

modified version of the Calgary Biofilm Pin Lid Device (CBPD) and an original model of 85 

Dacron^®-related biofilm. Then, cloxacillin, vancomycin, daptomycin whether or not 86 

combined with rifampicin, were evaluated in a new mouse vascular-material infection model, 87 

using the same strains of S. aureus.

88 

89 

Materials and methods

90 

Bacterial strains 91 

Six different strains of S. aureus were used for all experiments. For MSSA: two different 92 

clinical strains, thereafter named 171 and 176, isolated from patients with S. aureus 93 

bloodstream infections, and one strain from the American Type Culture Collection: ATCC 94 

27217. For MRSA: two different strains, thereafter named BCB8 and 117, also isolated from 95 

blood cultures, and one ATCC strain: ATCC 33591. Bacteria were stored in a cryovial bead 96 

preservation system at -80°C.

97 

98 

Antimicrobial agents 99 

Clinical forms of the following antibiotics were used: cloxacillin (Astellas Pharma, Levallois-100 

Perret, France) stored in a 100 mg/mL stock-solution, vancomycin (Sandoz, Levallois-Perret, 101 

France) stored in a 50 mg/mL stock-solution, daptomycin (Novartis Pharma SAS, Rueil-102 

Malmaison, France) stored in a 50 mg/mL stock-solution and rifampicin (Sanofi-Aventis, 103 

Paris, France) stored in a 60 mg/mL stock-solution. All the stock-solutions were prepared in 104 

sterile and pyrogen-free 0.9% saline except for rifampicin prepared in sterile water, and stored 105 

at -80°C before utilization.

106 

107 

In vitro experiments 108 

All the following experiments were performed at least in duplicate, with all the 109 

staphylococcal strains evaluated. For each strain, we measured the MICs and the MBCs, the 110 

MBICs and the MBECs, and the Dacron^®-related minimal biofilm inhibitory concentrations 111 

(dMBICs) and the Dacron^®-related minimal biofilm eradicating concentrations (dMBECs).

112 

Biofilm formation was compared between polystyrene (CPBD) and Dacron^® using confocal 113 

microscopy.

114 

MICs and MBCs 115 

The MICs and the MBCs values for cloxacillin, vancomycin, daptomycin and rifampicin were 116 

determined by the broth macrodilution method in cation-adjusted Mueller-Hinton broth 117 

(CAMHB), according to the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing 118 

(EUCAST). Media were supplemented with 50 mg/L Ca²⁺ for daptomycin.

119 

MBICs and MBECs 120 

A modified Calgary device was used as previously described.^{138, 145} Briefly, biofilm was 121 

formed by immersing pegs of a modified microtiter lid into wells of a flat-bottom 96-well 122 

microtiter plate. Each well was filled with 150 µL of a 3 McFarland S. aureus broth medium 123 

solution. After a 24-h incubation at 37°C, pegs lids were rinsed 3 times in sterile water, placed 124 

onto flat-bottom microtiter plates containing antibiotic twofold dilutions in 150 µL of 125 

CAMHB per well, and incubated for 24 h at 37°C. The MBIC were defined as the minimal 126 

concentration of antibiotic required inhibiting bacterial growth, as determined by reading 127 

MBEC was defined as the minimal concentration of antibiotic where no bacterial growth was 132 

documented.

133 

dMBICs and dMBECs 134 

Commercially available woven Dacron^® grafts (Cardial^TM, Bard, Saint-Etienne, France) were 135 

cut into 1 cm x 1 cm squares and sterilized. To cover the biomaterial with proteins and thus to 136 

(control groups) or serial antibiotic dilutions, and incubated during 24 h at 37°C. dMBIC for 143 

each antibiotic and strain couple was defined as the antibiotic concentration of the first tube 144 

with no visible bacterial growth. Then, Dacron^® patches for which no bacterial growth was 145 

documented, were removed from their tubes, rinsed 3 times in sterile water, dried with a 146 

sterile gauze compress and plunged again in MHB. A sonication (35kHz during 5 minutes) 147 

was performed followed by vortexing for 30 seconds and these MHB containing the Dacron^® 148 

sheets were incubated 24 h at 37°C. dMBECs were defined as the antibiotic concentration of 149 

the first tube with no bacterial growth.

150 

Confocal microscopy evaluating biofilm formation depending on the support 151 

Twenty-four h-biofilms prepared as previously described were observed using a Leica TCS 152 

SP5 confocal laser scanning microscope (Leica Microsystems, France) implemented at the 153 

Centre de Photonique Biomédicale(CPBM, Orsay, France). Bacteria were stained with 2.5 154 

500 and 600 nm for Syto9® and between 640 and 750 nm for PI. Images were acquired using 158 

a 63x with a 1.4 numerical aperture oil immersion objective. The size of the confocal images 159 

was 512 x 512 pixels (82x82 µm²), recorded with a z-step of 1 µm and a 3x zoom. For each 160 

biofilm, at least four different regions were analysed. Images of the biofilm prepared on the 161 

In vivo experiments 165 

All experiments were approved by the French ministry of research and the committee of 166 

animal ethics of the Pays de la Loire administrative region.

167 

Animals 168 

Four-weeks old female Swiss mice (RjOrl/SWISS, Janvier laboratory St Berthevin, France) 169 

weighing approximately 20 g were maintained on a 12-h light/dark cycle with free access to 170 

food and water. Their well-being was checked daily. Eight to 15 animals per group were used

healthy female Swiss mice during 24 h at 37°C. Then, they were implanted into mice.

175 

Surgical procedures 176 

Mice were anesthetized with ketamine (70 mg/kg) and Xylazine (10 mg/kg) through 177 

intraperitoneal (IP) injection. Under sterile conditions, a 10-mm horizontal incision in the 178 

center of the back, with the mouse in the prone position, was made to create a subcutaneous 179 

pocket. For each mouse, a sterile Dacron^®patch was implanted into this pocket. Skin was 180 

closed with sutures (Vicryl 5/0). Two days after Dacron^® implantation, a saline solution (0.2 181 

mL) containing 10⁷ CFU of S. aureus was transcutaneously inoculated onto the graft surface 182 

with a tuberculin syringe. During inoculation, mice were anesthetized with isoflurane 183 

(0.8L/min, 3%).

184 

Antimicrobial treatment regimens 185 

All the antibiotics used were administered at appropriate dose regimens resulting in serum 186 

concentrations similar to those in humans. Mice were randomized into 14 groups. For MRSA:

187 

no treatment (controls); vancomycin group (subcutaneous injection (SC), 110 mg/kg/12h);¹⁴⁶ 188 

daptomycin group (50 mg/kg/24h, SC);¹⁴⁷ Rifampicin group (30 mg/kg/12h, IP);¹⁴⁸ 189 

vancomycin-rifampicin group; daptomycin-rifampicin group; for MSSA: same groups + 190 

cloxacillin group (200 mg/kg/12h, SC)¹²⁶ and cloxacillin-rifampicin group. Vancomycin and 191 

cloxacillin solutions were prepared in sterile 0.9% saline, daptomycin in sterile Ringer-192 

Lactate and rifampicin in sterile 5% glucose serum. Mice were treated during 48 h and then 193 

euthanized following international guidelines.

194 

Bacterial counts 195 

Dacron^®patches were removed under aseptic conditions, homogenized in 0.5 mL of saline

Animals with positive bacterial culture of spleen were considered to be bacteriemic. In case of 202 

positive bacterial culture, in vitro drug susceptibility testing were performed using the Vitek 2 203 

automated identification and susceptibility testing system with the Advanced Expert System 204 

(bioMerieux, Lyon, France), and interpreted according to the EUCAST criteria.

205 

Statistical analysis 206 

GraphPad prism software (version 6.0; GraphPad Software, San Diego, CA, USA) was used.

207 

Normally distributed data were analyzed using analysis of variance to compare the effects 208 

between the different groups, followed by a Bonferroni’s test to compare the groups two by 209 

two. P<0.05 was considered to be statistically significant.

210 

211 

Results

212 

In vitro efficacy of antibiotics in biofilm are influenced by the nature of the support 213 

Confocal microscopy confirmed a biofilm formation for all the strains on polystyrene (Figure 214 

1a), or Dacron^® (Figure 1b). However, biofilms formed on Dacron^® sheets were less dense 215 

and thick as compared to those found with the modified CPBD.

216 

MBICs and MBECs measures demonstrated a dramatic reduction of bacterial susceptibilities 217 

to all antibiotics tested, for all strains. dMBICs and dMBECs were also higher than MICs and 218 

MBCs for all strains tested. However, decreases of susceptibilities were less pronounced on 219 

Dacron^® than on polystyrene, with the modified Calgary device (Table): for all the conditions 220 

evaluated, MBECs were much more higher than dMBECs.

221 

222 

Daptomycin efficacy on MRSA vascular material infection is superior to comparators 223 

for one strain but not for the others 224 

There was no difference between bacterial cultures before and after Dacron^® sonication. For 225 

MRSA BCB8, vancomycin demonstrated efficacy with significant decrease of bacterial count 226 

as compared to the control group (- 2.38 log10 CFU/cm², P< 0.05), but daptomycin was 227 

significantly more bactericidal with a dramatic reduction of bacterial load after a 48 h 228 

treatment (- 5.85 log10 CFU/cm²as compared to the control group, P< 0.001, and - 3.47 log10

treatment (- 5.85 log10 CFU/cm²as compared to the control group, P< 0.001, and - 3.47 log10

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