3.4.1.1 Determinação do índice de emulsificação E24
Como já mencionado no item 3.1, este teste tem como objetivo avaliar a estabilidade da camada de emulsão formada a partir da mistura de dois líquidos com diferentes graus de polaridade, portanto, imiscíveis.
Consiste em adicionar um volume de 2 mL de um cultivo de 7 dias, previamente separado das células por centrifugação na temperatura ambiente a 5.000 rpm por 15 minutos, em um tubo de ensaio (13x100 mm) já contendo o mesmo volume de querosene (ou qualquer outro substrato hidrofóbico). Esse tubo foi então submetido à agitação vigorosa (Vortex) por 2 minutos, após o qual permaneceu em repouso por 24 horas à temperatura ambiente. Após este período, o índice de emulsão foi calculado dividindo-se a altura da camada de emulsão pela altura total do volume líquido, multiplicado por 100 (Equação 1), resultando em uma medida que expressa a porcentagem emulsificada (Figura 9).
E24(%) =
Altura da Camada de Emulsão Altura total . 100
Equação 1 – Equação para cálculo do índice de emulsificação.
Figura 9 – Foto mostrando a emulsão formada como resultado do teste do E24. Fonte: Elaborada pela autora.
3.4.1.2 Extração e obtenção de massa bruta do biossurfactantes
A massa seca bruta de BS produzida foi estimada utilizando-se o método da precipitação ácida, descrito por Cooper e colaboradores.65
O BS é isolado de uma cultura submetida à centrifugação à 25°C por 40 minutos à 10.000 rpm para a retirada da biomassa de células; o caldo livre de células tem seu pH ajustado para 2 através da adição de ácido clorídrico concentrado. Em seguida, o caldo acidificado é mantido em refrigeração em geladeira (4°C) overnight. Após esse período, a amostra é novamente centrifugada por 40 minutos a 10.000 rpm e o sobrenadante é descartado. O precipitado resultante é ressuspendido em 20 mL de água destilada e é centrifugado a 15.000 rpm por 30 minutos; este processo é feito duas ou mais vezes para a remoção de sais ou outras impurezas que ainda podem estar presentes. Após esse processo, o precipitado é ressuspendido em 20 mL de água destilada e seu pH é ajustado para 7 com NaOH 7,5 M. Em seguida é encaminhado para um concentrador a vácuo (SpeedVac™) para o processo de secagem, por 12 horas. O rendimento, em gramas por litro de meio de cultura, é calculado pesando-se o resultante desta secagem.
3.4.1.3 Determinação da Tensão Superficial (TS) e da Tensão Interfacial (TI)
As medidas de tensão superficial e interfacial foram realizadas segundo o método do anel de Du Nouy, descrito por Bodour e colaboradores66, utilizando-se um aparelho denominado de tensiômetro automático de força (marca Attension, modelo Sigma).
Para as medidas de TS, pode-se utilizar 20 ml de uma solução de biossurfactante na concentração de 5ppm ou o mesmo volume do caldo livre de células dos cultivos em estudo; para ambos o seguinte procedimento é o mesmo: são colocados num copo de vidro limpo de 50 mL e, que em seguida, é levado para a plataforma do tensiômetro. O anel do fio de platina (do aparelho) é então submerso na solução (ou no caldo) e, em seguida, puxado lentamente através da interface líquido-ar, para medir a tensão superficial (mN/m). Entre cada medição, o anel de platina é lavado com acetona e hexano 60% e depois flambado em chama até o rubro.
Para as medidas de TI, um volume de 15 mL de uma solução contendo BS (na concentração de 5 ppm) foi colocada num copo de vidro limpo de 50 mL juntamente com 15 mL de hexadecano; o copo então foi colocado na plataforma do tensiômetro. Devido à diferença de densidade entre a água da solução e o hexadecano ocorre a formação de duas fases: a água com o BS ficam na fase inferior, enquanto que o hexadecano fica na fase
superior. O anel de fio de platina (do aparelho) é então submerso até a interface entre as duas soluções para a medida da tensão interfacial (mN/m). Como controle também foram realizadas medidas da tensão interfacial entre a água destilada e o hexadecano.
3.4.1.4 Quantificação de proteína total do biossurfactante
A análise do conteúdo de proteínas foi realizada usando-se o kit comercial Pierce® BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific),67 seguindo o protocolo do fabricante. O kit é composto por dois reagentes de trabalho (A e B) e seu padrão é apresentado com albumina bovina (2mg/mL). Este método combina a redução de íons Cu2+ para Cu+1 pela proteína em meio alcalino, com alta sensibilidade e detecção colorimétrica seletiva dos cátions de cobre usando ácido bicinóico. A reação de coloração, apresentada pela coloração roxa, ocorre pela quelação do ácido bicinóico com o íon de cobre disponível.
O reagente de trabalho foi preparado misturando-se as soluções A e B (50:1). Em uma microplaca de 96 poços, uma alíquota de 25 μL da amostra estudada (no caso, BS semi- purificado na concentração de 2mg/ml) ou do padrão albumina foi adicionada em cada um dos poços, seguida de 200 μL de reagente de trabalho. A placa foi agitada por 30 segundos e incubada por 30 minutos a 37 ºC; em seguida, resfriada a temperatura ambiente e sua absorbância foi medida em 562 nm.
3.4.1.5 Determinação de ácidos graxos do biossurfactante
Esta análise foi realizada no laboratório do Grupo de Química Orgânica e Biocatálise do Instituto de Química de São Carlos (IQSC-USP), pela Dra. Rafaely Nascimento Lima, que usou o protocolo descrito a seguir. Uma amostra de 5 mg do BS semi-purificado foi esterificada utilizando o método de esterificação de Fischer, sendo adicionado a um frasco de 5 mL, 1 mL de etanol, 1 mL de tolueno e 1 gota de ácido sulfúrico concentrado. A amostra foi mantida em aquecimento a 70 °C por 24 horas; após esse tempo ela foi submetida à extração líquido-líquido empregando 20 mL de acetato de etila e 10 mL de solução de NaHCO3 a 10%,
por 3 vezes. À fase orgânica adicionou-se sulfato de sódio anidro para retirada de água remanescente. O solvente orgânico foi então evaporado sob pressão reduzida, utilizando-se rota-evaporador, e o produto obtido foi submetido à análise pela técnica de cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM68). O produto da reação foi analisado em um cromatográfo a gás GCEMQP2010 Ultra (Shimadzu Corporation, Japão), equipado com um amostrador de injeção automática AOC-20i (Shimadzu). A separação dos componentes da
amostra foi realizada em uma coluna capilar de sílica fundida (DB-5MS 5%-fenil-95%- dimetilpolisiloxano 30 m x 0,25 mm de diâmetro interno, 0,25 mm de espessura de filme), em um fluxo constante de gás hélio 5,0 de 0,65 mL min-1. A temperatura do injetor foi de 260 °C e 1,0 µL de amostra foi injetada com Split 10. O espectro de massas foi obtido pela ionização dos compostos por impacto de elétrons (70 eV) e análise dos fragmentos com m/z de 40 a 500 em aparelho quadrupolo. A temperatura da fonte de íons permaneceu em 260 °C e da interface a 300 °C. A programação de temperatura do forno iniciou-se a em 50 °C, com um aumento de 5 °C min-1 até 300 °C, permanecendo por 5 min. O tempo total de análise foi de 55 min.