Nos isolamentos preliminares com folha, testou-se uma combinação de enzimas baseada na de Dorion et al. (1994) utilizada para folhas de Ulmus. Estes autores conseguiram isolar protoplastos de folhas jovens usando a seguinte combinação com as respectivas concentrações de enzimas digestivas: 0,2% Celullase Onozuka RS + 0,1% Driselase + 0,03% Pectolyase Y23. Na combinação testada, a Pectolyase Y23 foi substituída por Macerozyme Onozuka R10, por impossibilidade de aquisição da primeira. Esta combinação, nas concentrações acima referidas, não forneceu resultados positivos. Nos vários ensaios que foram realizados, as tiras de folha ficaram apenas macias e não houve qualquer libertação de células ou de protoplastos. Por esta razão, escolheram-se posteriormente novas combinações enzimáticas (Tabela 4.3), usando as enzimas que havia disponíveis e as combinações referidas com sucesso num artigo de revisão de isolamento de protoplastos de folhas de lenhosas (Kirby et al. 1989). Aquelas combinações eram, de uma forma geral, constituídas apenas por uma celulase e uma pectinase e as concentrações variavam entre 0,5 e 2,0% para a celulase e 0,1 e 0,5% para a pectinase, concentrações estas que eram bastante superiores às utilizadas por Dorion et al. (1994). Testaram-se então as combinações e concentrações indicadas na Tabela 4.3 com especial ênfase para a comparação entre a Cellulase Onozuka R10 e a Cellulase Onozuka RS. Para além disso,
testou-se a influência da adição de 0,1% de Driselase, uma vez que esta segunda celulase estava presente na combinação utilizada por Dorion et al. (1994).
Tabela 4.3 Rendimentos das diferentes combinações de enzimas testadas no isolamento de protoplastos das três primeiras folhas de plantas in vitro. Os valores são as médias e desvios padrão de dois a quatro isolamentos para cada combinação. Os valores seguidos de letra diferente são significativamente diferentes (P < 0,05). Os testes estatísticos foram efectuados entre as várias combinações com a mesma celulase, e entre as combinações que apenas diferiam na celulase, para testar a eficácia das enzimas
Folhas in vitro Enzimas % (p/v)
Rendimento
(protoplastos / grama peso fresco)
Testes estatísticos entre as combinações com Cellulase R10 1,0% Cel. Onoz. R10 + 0,25% Mac. Onoz. R10
1,0% Cel. Onoz. R10 + 0,25% Mac. Onoz. R10 + 0,1% Driselase 1,0% Cel. Onoz. R10 + 0,25% Pectinase
1,0% Cel. Onoz. R10 + 0,25% Pectinase + 0,1% Driselase
Testes estatísticos entre as combinações com Cellulase RS 1,0% Cel. Onoz. RS + 0,25% Mac. Onoz. R10
1,0% Cel. Onoz RS + 0,25% Mac. Onoz. R10 + 0,1% Driselase 1,0% Cel. Onoz. RS + 0,25% Pectinase
1,0% Cel. Onoz. RS + 0,25% Pectinase + 0,1% Driselase
7,04 x 106 + 1,68 x 106 a 1,00 x 107 + 3,68 x 105 a 1,04 x 107 + 1,15 x 106 a 1,07 x 107 + 2,06 x 106 a 2,64 x 107 + 1,45 x 107 a 2,98 x 107 + 7,35 x 106 a 2,72 x 107 + 1,96 x 107 a 3,96 x 107 + 1,24 x 107 a 2,0% Cel. Onoz. RS + 0,5% Mac. Onoz. R10 3,17 x 107 + 1,03 x 107 a Testes estatísticos entre as combinações com Cellulase R10 ou RS
1,0% Cel. Onoz. R10 + 0,25% Mac. Onoz. R10 1,0% Cel. Onoz. RS + 0,25% Mac. Onoz. R10
7,04 x 106 + 1,68 x 106 a 2,64 x 107 + 1,45 x 107 b 1,0% Cel. Onoz. R10 + 0,25% Mac. Onoz. R10 + 0,1% Driselase
1,0% Cel. Onoz. RS + 0,25% Mac. Onoz. R10 + 0,1% Driselase
1,00 x 107 + 3,68 x 105 a 2,98 x 107 + 7,35 x 106 a 1,0% Cel. Onoz. R10 + 0,25% Pectinase
1,0% Cel. Onoz. RS + 0,25% Pectinase
1,04 x 107 + 1,15 x 106 a 2,72 x 107 + 1,96 x 107 b
1,0% Cel. Onoz. R10 + 0,25% Pectinase + 0,1% Driselase 1,0% Cel. Onoz. RS + 0,25% Pectinase + 0,1% Driselase
1,07 x 107 + 2,06 x 106 a 3,96 x 107 + 1,24 x 107 b
Cel. Onoz. RS – Cellulase Onozuka® RS; Cel. Onoz. R10 – Cellulase Onozuka® R10; Mac. Onoz. R10 – Macerozyme Onozuka R10 (Yakult Pharmaceutical Ind. Co.,Ltd); Driselase (de Basidiomycetes Sigma®); Pectinase (de Rhizopus sp. Sigma®)
Em todas as combinações de enzimas que foram testadas houve sempre produção de protoplastos. Notoriamente, o factor principal que desencadeou este resultado parece ter sido a elevação da concentração das enzimas, uma vez que, a combinação que tinha sido preliminarmente testada, sem sucesso, fornecia agora resultados positivos. Esta poderá ser
a razão para o facto de Dorion et al. (1983) referirem que a combinação de Cellulase Onozuka R10 com a Macerozyme R10 era ineficaz na produção de protoplastos de Ulmus, uma vez que as baixas concentrações por eles usadas são geralmente referidas para espécies herbáceas de mais fácil digestão (Power e Chapman 1985).
O uso das celulases Onozuka R10 e Onozuka RS foi comparado testando os rendimentos obtidos em combinações enzimáticas que apenas diferiam na celulase (Tabela
4.3). Apenas o par de combinações com 1,0% Cellulase Onoz. R10 ou RS + 0,25%
Macerozyme Onoz. R10 + 0,1% Driselase mostrou rendimentos que não eram
significativamente diferentes. Todos os outros pares de combinações mostraram que os rendimentos fornecidos pela Cellulase Onozuka RS eram significativamente superiores aos registados com a Cellulase Onozuka R10. Os testes estatísticos também mostraram que os rendimentos obtidos com as combinações enzimáticas que possuíam a mesma celulase não eram significativamente diferentes. Estes dados provaram que as pectinases aqui utilizadas foram da mesma forma efectivas na produção de protoplastos de ulmeiro e que a adição da Driselase não demonstrou qualquer vantagem.
Apesar de não se verificarem diferenças significativas entre as diferentes combinações enzimáticas que possuíam a mesma celulase (Tabela 4.3), os valores obtidos nos diferentes isolamentos de uma mesma combinação foram, no entanto, bastante variáveis. Mesmo tendo o cuidado de padronizar toda a técnica de isolamento e de usar material em estado de desenvolvimento semelhante, houve sempre uma grande diferença de valores, de isolamento para isolamento. Por exemplo, na combinação 1,0% Cel. Onoz. RS + 0,25% Mac. Onoz. R10 o valor máximo obtido foi de 4,69 x 107 pp/g p.f. e o valor mínimo foi de 1,40 x 107 pp/g p.f. Dorion et al. (1994) também referiram, no seu trabalho, uma grande variabilidade de resultados de uma experimentação para outra.
Os dados aqui obtidos contrastam com os de Dorion et al. (1994) que referiram a necessidade de usar uma pectinase mais activa como a Pectolyase Y23 (Ishii 1989) (uma enzima muito dispendiosa) e que, entre as celulases, apenas a Cellulase RS era eficiente. Este grupo referiu que com folhas de um clone de U. minor, micropropagado durante sete
anos, atingiram uma média de 3,7 x 107 pp/g p.f. No nosso caso, e usando folhas de
material que já vinha sendo micropropagado há cinco anos, os rendimentos obtidos variaram entre 2,64 - 3,96 x 107 pp/g p.f., usando a Cellulase Onozuka RS, valores estes que estão muito próximos do acima referido.
Os protoplastos obtidos a partir de folha eram perfeitamente esféricos com um elevado número de cloroplastos e com diâmetro que variava entre 10 e 25 µm (Fig.s 4.1B e
4.1C).
Figura 4.1 Isolamento de protoplastos de calo e de folha. (A) Protoplastos de calo recentemente isolados que exibem um largo intervalo de diâmetros (a barra vale 40 μm). (B) Protoplastos de folha observados logo após o seu isolamento (a barra vale 20 μm). (C) Protoplastos de folha observados após purificação (a barra vale 20 μm).