5.3.5.1 Tipos de embriogénese repetitiva obtida a partir de e.p.g.s
Uma vez que os e.p.g.s de morfologia anormal não se convertiam em plantas, testou-se a sua utilização como fonte de material em ensaios de embriogénese repetitiva conduzidos em meio base de MS.
Estes foram então subcultivados, ferindo-os ligeiramente com a lâmina do bisturi, e colocando, o mais possível, a sua superfície em contacto com o meio de cultura (Fig. 5.13A). Devido a este procedimento dois tipos de resultados foram observados: a formação indirecta de embriões somáticos em calo embriogénico formado de novo (Fig. 5.13B) e a formação directa de embriões somáticos, em diferentes fases, sobre cotilédones, hipocótilos ou raízes, sem a intervenção de calo embriogénico (Fig.s 5.13C – 5.13E). Estes acontecimentos ocorreram em simultâneo numa mesma placa, mas a diferentes frequências. O resultado de visualização mais comum foi a produção calo embriogénico formado de novo e a produção directa de embriões secundários foi observada de forma esporádica.
Foi a partir do calo embriogénico formado de novo e também em embriões secundários de origem directa, que se observaram as diferentes fases da ontogénese dos embriões somáticos de ulmeiro. Os embriões obtidos por embriogénese secundária directa possuíam contornos mais definidos e uma morfologia mais perfeita (Fig.s 5.13C – 5.13E) que os produzidos no calo embriogénico formado de novo (Fig. 5.13B). No calo embriogénico formado de novo os embriões apareciam muito agrupados sendo, por vezes, difícil distinguir as diferentes fases. Este efeito foi ainda mais pronunciado em meio solidificado com agar purificado do que em meio solidificado com gelrite. Para além disso, no calo embriogénico formado de novo foi frequente a visualização de embriões de anormal morfologia, como por exemplo, embriões com os cotilédones fundidos num só (Fig. 5.15C; visualização em M.E.V. Fig. 5.18B). O calo embriogénico formado de novo apresentou uma maior sincronia (Fig. 5.15A – 5.15D), na formação de embriões, do que os embriões de origem directa, uma vez que estes podiam ser observados em diferentes fases de desenvolvimento sobre o embrião inicial (Fig. 5.13C e 5.13E).
Figura 5.13 Embriogénese repetitiva a partir de embriões precocemente germinados (e.p.g.s) em meio basal de MS. (A) Exemplo de embriogénese repetitiva a partir do embrião apresentado na Figura 5.12D (a barra vale 1,5 mm). (B) Calo embriogénico formado de novo, de aspecto nodular, que apresenta essencialmente embriões em fase globular (a barra vale 0,4 mm). (C) Embriões globulares e em fase de torpedo, de origem directa, formados sobre os cotilédones de um e.p.g. (a barra vale 182 µm). (D) Embriões globular e cotiledonar sobre o hipocótilo de um e.p.g. (a barra vale 273 µm). (E) Embriões globulares e em coração sobre a raiz de um e.p.g. (a barra vale 136 µm). (F) Embriões da figura anterior, fotografados vinte dias depois e com sete dias de sujeição à luz (a barra vale 0,3 mm).
A
B
C
D
E
5.3.5.2 Embriogénese repetitiva via produção de calo embriogénico formado de novo
O calo embriogénico formava-se, aproximadamente, três semanas após a subcultura dos embriões para meio base. Este era um pouco translúcido, de cor amarela muito clara e mostrava desde muito cedo, organização celular. Quando visto em esfregaços com carmim acético mostrava características semelhantes às observadas em esfregaços de calo embriogénico obtido nos meios de indução (ver secção 5.3.1.3 Indução de calo embriogénico e confirmação da natureza do calo). Nestes esfregaços foram, por vezes, visíveis embriões já diferenciados como o apresentado na Figura 5.14A que se encontrava ao lado de um outro numa fase de diferenciação mais avançada. Como já referido para os e.p.g.s, estes embriões também possuíam tricomas que apareciam nas fases mais diferenciadas (Fig. 5.14B; visualização em M.E.V. Fig.s 5.18C e 5.18D).
Figura 5.14 Observação de esfregaços de calo embriogénico formado de novo em carmim acético. (A) Esfregaço que mostra a presença de embriões estando aqui em evidência um embrião globular ao lado de um outro numa fase de desenvolvimento mais avançada (a barra vale 155 µm). (B) Observação de tricomas na zona dos cotilédones num embrião em fase de diferenciação avançada (a barra vale 99 µm).
Inicialmente o calo embriogénico formado de novo apresentava a sua superfície sob a forma de imensos nódulos (Fig. 5.15A), embriões globulares muito juntos, que progressivamente iam evoluindo passando pelas diferentes fases da sua diferenciação, alcançando a fase cotilédonar (Fig. 5.15C) na quinta semana após a subcultura.
Figura 5.15 Evolução de um explante de calo embriogénico formado de novo em meio basal de MS com 3% de sacarose. (A) Calo embriogénico de aspecto nodular que apresentava na sua superfície imensos embriões, muito juntos, em fase globular (a barra vale 300 µm). (B) Uma semana mais tarde, os embriões já se encontravam num estado mais avançado sendo já visíveis embriões em fase de torpedo (a barra vale 300 µm). (C) Após outra semana, o explante apresentava já embriões em fase cotiledonar sendo, nesta altura, transferido para a luz (a barra vale 444 µm). (D) Após transferência para a luz os embriões adquiriram cor verde e o número de tricomas aumentou (a barra vale 444 µm). (E) Alongamento do hipocótilo e dos cotilédones de um embrião somático (a barra vale 0,8 mm). (F) Obtenção de uma planta completa que foi separada do resto do explante (a barra vale 9 mm). (G) Calo embriogénico que em presença de luz dá origem, num ciclo repetitivo, a novos embriões somáticos e a novo calo embriogénico (a barra vale 1 mm).
C
A B
D
E
Na Figura 5.15 é apresentada uma sequência de quatro fotografias de um mesmo explante, mantido no escuro até à obtenção de embriões cotiledonares, desde a altura em que apresenta apenas embriões globulares até uma semana depois da sujeição à luz (Fig.
5.15A – 5.15D. A Figura 5.15E é representativa do alongamento do hipocótilo e da
expansão dos cotilédones dos embriões neste material e na Figura 5.15F é apresentado um embrião germinado que mostra a raiz, os dois cotilédones e três jovens folhas. Em condições de luminosidade, a par com a diferenciação dos embriões e a conversão em plantas existe, simultaneamente, a proliferação constante do calo embriogénico (Fig. 5.15G). Nestas condições, o calo apresenta uma cor amarela, dourada sendo intercalado por zonas verdes de embriões já formados (Fig. 5.15G). Desde a sua obtenção, o calo embriogénico formado de novo foi mantido em cultura durante três anos.
5.3.5.2.1 Germinação e conversão de embriões de calo embriogénico formado de novo
Como já referido, a partir do calo embriogénico formado de novo obtiveram-se embriões somáticos que mostraram todo o seu processo de diferenciação e que germinaram directamente no meio de proliferação. Após a obtenção dos embriões em fase cotiledonar os cotilédones expandiam, esverdeavam e mostravam um acentuado número de tricomas, sendo acompanhados pelo alongamento da raiz e do hipocótilo (Fig. 5.15E). Logo após este desenvolvimento formavam-se as primeiras folhas (Fig. 5.15F). Pequenos grupos de plantas, nestas condições, foram transferidas para o meio de conversão C1, tendo-se comportado como os e.p.g.s. As pequenas plantas tinham características de crescimento semelhantes às observadas nas plantas obtidas a partir de e.p.g.s (Fig. 5.9A), não havendo variação ao nível da morfologia e tamanho da folha, espessura e alongamento do caule e das raízes.
5.3.5.2.2 Determinação do nº de embriões em calo embriogénico formado de novo
Em ensaios de transferência de explantes de calo embriogénico formado de novo para novo meio base de MS com 3% de sacarose obtiveram-se, seis semanas após a
subcultura, 592 embriões com cotilédones verdes (contagem feita uma semana depois de serem transferidos para a luz). A percentagem de explantes formadores de embriões somáticos foi de 78,1% (+ 19,8) (64 explantes), com uma média do número de embriões por explante igual a 9,3 (+ 5,1) e uma média do número de embriões por explante formador igual a 11,5 (+ 4,0). Tendo cada um dos explantes transferidos cerca de 0,022 g, a estimativa do número médio de embriões por grama deste calo atingiu o valor de 423 embriões somáticos.