1-1 Les prélèvements
L’étude a été réalisée entre Mars 2009 et Août 2010, sur des prélèvements provenant de patients suspectés d’être atteints de tuberculose. Elle a porté sur un total de 3682 prélèvements (tableau 4) réceptionnés au niveau de l’unité de la tuberculose du laboratoire de Bactériologie du Centre Hospitalo-Universitaire Benbadis de Constantine.
Tableau 4 : les prélèvements étudiés pour l’isolement des actinomycètes.
Type de prélèvements Prélèvements Nombre prélèvements
Prélèvements contaminés Crachats 3037 Urines 280 Pus 43 Sang de règles 7 Sperme 2 Adénite suppurée 1 Prélèvements inguinale 5 Prélèvements non contaminés Liquide pleural 157 Ascite 72 Liquide céphalo-rachidien 32 Liquide articulaire 20 Prélèvement cutané 3 Biopsie 3 Lavage broncho-alvéolaire 3 Ponction trachéal 2 Ganglion cervical 2 Aspiration bronchique 2 Drain thoracique 2 Kyste 2 Myeloculture 1 Suppuration ganglionnaire 2 Epanchement péricardique 1 Abcès du psoas 1 TOTAL 3682
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1-1-1 Prélèvements contaminés
1-1-1-1 Les prélèvements respiratoires non protégés
Il s’agit de crachats et/ou expectorations (CRA), d’aspirations bronchiques (AB), d’aspirations trachéales (ATR) et de tubage gastrique. Il est nécessaire d’examiner ces prélèvement afin d’évaluer, la contamination salivaire, donc la validité des prélèvements, ainsi que leur purulence. Si le prélèvement est spumeux, il est impropre à l’analyse bactériologique. Par contre, le prélèvement est étudié, s’il est purulent ou mucopurulent. Les prélèvements sont réalisés, si possible, dans l’heure qui suit le lever des patients (la remobilisation du malade après une nuit de sommeil aide à la production d’expectoration de bonne qualité) avant antibiothérapie et après rinçage de la bouche au sérum physiologique stérile. Les prélèvements sont recueillis dans des pots stériles et acheminés rapidement au laboratoire (conservation possible de ces prélèvements 48 h à + 4°C).
1-1-1-2 Les urines : il s’agit de la totalité des urines du matin recueillie stérilement et concentrée par centrifugation à 4 000 g dans un nombre suffisant de tubes Falcon. Le culot est mis en suspension dans 1 ml de surnageant.
1-1-1-3 Autres prélèvements : pus d’abcès ouverts d’adénite suppurée, de collection inguinale, de sperme et de sang de règles.
1-1-2 Prélèvements non contaminés
1-1-1-1 prélèvements internes : il s’agit de prélèvements normalement stériles, ce sont les liquides pleuraux (LP), les liquides céphalorachidiens (LCR), l’ascite, les pus d’abcès fermés, la moelle osseuse, les kystes du sein, l’abcès du psoas, liquide synovial, etc. Les liquides clairs sont centrifugés pendant 30 mn à 1500 g. Les culots sont suspendus dans quelques gouttes de surnageant.
1-1-1-2 Les prélèvements respiratoires protégés : les lavages broncho-alvéolaire (LBA), les brossages bronchique (BB) et les ponctions trachéale (PTT).
1-1-1-3 Les tissus : ce sont des biopsies ganglionnaires, pulmonaires ou autres. Elles
sont acheminés rapidement au laboratoire, immergées dans du sérum physiologique stérile, ou humidifiées. Elles sont dilacérées et broyées stérilement. La moitié du
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prélèvement est diluée au ¼ et l’autre est soumise à une décontamination fluidification. Les mycobactéries sont recherchées sur les deux échantillons.
1-1-1-4 Les cathéters : une portion de 5 cm du cathéter est recueillie dans un tube stérile qui doit parvenir au laboratoire dans les plus brefs délais pour éviter un dessèchement excessif. Le cathéter est immergé en bouillon nutritif ou en sérum physiologique, « vortexé » 30 sec. à 1 minute.
1-2 Traitements des prélèvements
L’isolement des mycobactéries à partir de produits pathologiques contaminés nécessite la mise en œuvre de procédés de décontamination susceptibles de concilier une action énergique vis-à-vis de la flore d’accompagnement et une agressivité très faible vis-à-vis des bacilles acido-alcoolo-résistants. Le choix du traitement des produits pathologiques en vue de l’isolement des mycobactéries est fonction de la nature même de ces produits.
Pour la décontamination des échantillons :
- d’expectorations, la méthode à la soude utilisée est celle de Pétroff. Deux volumes de prélèvement sont mis dans un tube conique stérile, auxquels sont ajoutés deux volumes de solution de NaOH à 4% (annexe 3) en présence du bleu de bromothymol comme indicateur de pH coloré. Après agitation puis incubation dans une étuve à 37°C pendant 30 minutes, l’action de la solution de décontamination est stoppée par l’addition d’une solution d’acide sulfurique (H2SO4 à 15% annexe 3) jusqu’à neutralisation. Le mélange est ensuite centrifugé à 4 000 g pendant 20 minutes. Le culot est utilisé pour l’examen direct et la mise en culture.
- des écouvillons laryngés ou les pus d’abcès ouvert, 4 ml d’acide sulfurique à 4% sont ajoutés dans le tube à écouvillon. Après dix minutes d’action une neutralisation est réalisée par addition de 3,5 ml de NaOH à 6% (annexe 3).
- des biopsies, après broyage, il faut laisser agir l’acide sulfurique à température ambiante du laboratoire pendant 15 minutes en présence de quelques gouttes de bromothymol. La neutralisation est obtenue avec du NaOH à 6%.
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1-3 Recherche de BAAR à l’examen direct 1-3-1 Préparation des frottis
À partir des prélèvements éventuellement traités et enrichis, le frottis est confectionné par étalementhomogène, d’une faible épaisseur sur une surface de 2 cm2, ce qui permet une coloration optimale. Pour les urines et les liquides de ponctions, le culot est utilisé. Seul le LCR souvent en volume réduit est étalé sous forme de gouttes déposées et séchées sur le même endroit.
Les lames sont ensuite séchées et fixées sur une plaque chauffante électrique pendant deux heures à 65 °C.
1-3-2 Coloration de Dugommier à l’auramine
Après 10 minutes de contact à froid avec l’auramine, les frottis sont lavés puis décolorés 3 minutes par un mélange acide-alcool. Les lames sont lavées une deuxième fois et contre-colorées par la solution de permanganate de potassium et égouttées (annexe 3). Les mycobactéries prennent un aspect jaune-vert brillant et se détachent sur un fond rouge. La lecture se fait avec un microscope à fluorescence, à l’obscurité, à l’objectif x40. Toutes les lames qui présentent des résultats positifs sont colorées une deuxième fois par la coloration de Ziehl-Neelsen pour confirmer la présence des bacilles du complexe tuberculeux. Cette coloration est sensible mais longue (15 minutes par lames).
L’examen direct est important, il permet une réponse rapide, sa positivité signe la gravité de la pathologie ; dans le cas de prélèvements externes et de tuberculose, il signe la contagiosité du patient.
Nota-béné : les prélèvements correspondants aux lames considérées comme
lames faiblement, moyennement ou fortement positive vis-à-vis de la présence des bacilles du complexe tuberculeux (annexe 3) sont exclus des cultures pour la recherche des actinomycètes.
1-3-3 Coloration de Ziehl-Neelsen
Cette méthode utilise la fuschine comme colorant, le phénol permettant une meilleure fixation de celle-ci à chaud. La décoloration est ensuite assurée par un acide fort concentré comme l’acide sulfurique à 25 %, et de l’éthanol à 94 °C. Le bleu de
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méthylène est employé comme contre-colorant (annexe 3). La lecture se fait au microscope à transmission optique à l’objectif d’immersion.
1-4 stratégie d’isolement des actinomycètes
L’isolement des actinomycètes a été réalisé en deux périodes selon deux protocoles différents. La première période a duré huit mois où nous avons adopté le protocole utilisé dans l’unité de la tuberculose suivi d’une purification sur le milieu de Bennett. Durant la deuxième période d’isolement qui a duré onze mois nous avons opté pour un autre protocole d’isolement élaboré par nos soins.
1-4-1 Isolement des actinomycètes selon le premier protocole
1-4-1-1Les prélèvements
Tous les prélèvements reçus au niveau de l’unité ont été utilisés (pulmonaire ou non). Dans le cas des prélèvements récoltés des sites non contaminés, la mise en culture est effectuée directement sans prétraitement. Quant aux prélèvements récoltés de sites contaminés ils ont été au préalable décontaminés et fluidifiés (cf 1-2 traitements des prélèvements) pour ensuite être mis en culture.
1-4-1-2 La mise en culture
Les prélèvements sont mis en culture sur le milieu Lowenstein-Jensen (L-J) composé de sels minéraux, de glycérol, d’œuf et de vert de malachite. L’œuf permet la neutralisation des agents de décontamination encore présents dans le culot de décontamination.
Le milieu (L-J) permet la croissance du plus grand nombre d’espèces de mycobactéries par rapport aux autres milieux utilisés (Coletsos et BO Colestos). Ces derniers favorisent la croissance des mycobactéries les plus exigeantes ou micro aérophiles (M. bovis, M. africanum).
L’ensemencement se fait par inondation à travers le bouchon à raison d’un tube par prélèvement pour les prélèvements pulmonaires et deux tubes pour les autres prélèvements. Les tubes sont disposés sur des portoirs adaptés en position horizontale légèrement inclinée, le bouchon vers le haut, puis incubés à 37 °C.
Les premiers jours, les bouchons sont légèrement dévissés pour que le liquide résiduel s’évapore, par la suite ils sont revissés. Chaque tube est observé au moins deux fois par semaine jusqu’au 72ème jour d’icubation.
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Dans le cas d’absence de bactéries appartenant au genre Mycobacterium, toute
colonie présente sur le milieu L-J est repiquée et purifiée par la technique des stries sur
le milieu Bennett coulé en boites (figure 7) afin de chercher cette fois-ci les bactéries
actinomycétales. Les boites sont ensuite incubées à 28°C et examinées quotidiennement pendant deux mois.
Figure 7 : isolement des actinomycètes selon le premier protocole. 1-4-2 Isolement des actinomycètes selon le deuxième protocole
1-4-2-1 Les prélèvements
Seuls les prélèvements non pulmonaires, excepté l’urine, ont été étudiés. L’étape de la décontamination et de la neutralisation (cf 1-2 traitements des prélèvements) précédant la mise en culture des prélèvements contaminés a été supprimée (figure 8). 1-4-2-2 La mise en culture
Tous les prélèvements sont ensemencés par inondation, directement sur le milieu de Bennett coulé en boites de Pétri. Les cultures sont incubées à 28°C pendant deux mois et la lecture se fait quotidiennement. Les colonies actinomycétales sont repérées
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d’après leur aspect macroscopique. Leur appartenance à ce groupe est confirmée par examen microscopique après coloration de Gram.
Figure 8 : isolement des actinomycètes selon le deuxième protocole.